BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian eksperimental dengan metode post test only control group design. B. Tempat Penelitian Tempat pemeliharaan dan induksi hewan dilakukan di unit pemeliharaan hewan coba Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret. Pemeriksaan imunohistokimia dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret. C. Populasi dan Sampel Mencit betina sub spesies Mus musculus galur Balb/C umur 3-4 bulan yang berasal dari satu induk, berat badan 20 30 gram, diperoleh dari Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada. Bahan makanan mencit digunakan pakan mencit standar BR I. Pemilihan hewan coba mencit berdasarkan pertimbangan bahwa mencit Mus musculus paling sering dipakai pada penelitian biomedik, karena secara genetik mempunyai kemiripan dengan manusia dan mempunyai kemampuan beradaptasi dalam lingkungan laboratorium (Perry et al., 2011). Mencit sehat adalah mencit dengan kondisi mata bersinar, bulu tidak kusam, nafsu makan baik, dan aktif. D. Besar Sampel Penelitian eksperimental ini dilakukan pada populasi (N) tidak diketahui. Rumus yang dipakai untuk menentukan besar sampel (n) adalah: n = [ (Z½α+Zβ) ] 2 (Steel dan Torrie, 1980) Karena 2 studi yang sama sebelumnya atau studi pendahuluan oleh peneliti, maka diasumsikan 2 2, sehingga hasilnya n= (Z½ + Z ) 2 n = (1,645 + 0,842) 2 = 6,185 dibulatkan menjadi 7 Keterangan: 22
23 n = besar sampel masing-masing kelompok Z½ = nilai standar normal, yang besarnya tergantung Bila = 0,05 Z½ = 1,645 Z = nilainya tergantung yang ditentukan (berdasarkan tabel) = error untuk menerima H0, bila H0 salah Bila = 0,08 Z = 0,842 = selisih antara rerata variabel terapi dan kontrol yang diharapkan oleh peneliti σ = standar deviasi Berdasar rumus didapatkan jumlah sampel minimal adalah tujuh ekor. Dalam penelitian ini digunakan tujuh ekor mencit untuk setiap kelompok observasinya, sehingga telah memenuhi batas minimal sampel. E. Identifikasi Variabel 1. Variabel tergantung a. IL-17 b. TNF-α 2. Variabel bebas: a. Secretome F. Definisi Operasional Tabel 1. Definisi Operasional Variabel Parameter Definisi Alat Ukur IL-17 IL-17 adalah sitokin proinflamasi Metode yang diproduksi oleh limfosit Th17 imunohis teraktivasi. Ekspresi IL-17 tokimia didapatkan dari preparat imunohistokimia sampel ginjal mencit secara kuantitatif, dimana Satuan Data Jumlah ekspresi sel /100 sel makrofag Skala Data Rasio
24 jumlah area positif pewarnaan dan intensitas pewarnaannya pada lima lapang pandang dihitung rata-ratanya. TNF-α TNF-α merupakan sitokin Metode Jumlah Rasio proinflamasi dan imunoregulator. imunohis ekspresi Ekspresi TNF-α didapatkan dari tokimia sel /100 preparat imunohistokimia sampel sel ginjal mencit secara kuantitatif, makrofag dimana jumlah area positif pewarnaan dan intensitas pewarnaannya pada lima lapang pandang dihitung rataratanya. Secretome Adalah hasil sekresi sel punca Pipet ml Nomi mesenkimal yang berasal dari cairan mililiter nal amnion manusia, diperoleh dari PT. Dermama Bioteknologi Surakarta dan diberikan dalam dosis tunggal 0,45 ml secara intraperitoneal. G. Waktu Waktu yang diperlukan dalam penelitian ini selama 5 bulan dengan jadwal penelitian sebagai berikut. Jenis Kegiatan Bulan ke 1 2 3 4 5 1) Persiapan : memesan bahan-bahan, mengumpulkan kepustakaan diskusi, membuat log book.
25 2) Pelaksanaan penelitian : induksi model lupus, pemeriksaan IL 17 dan TNF-α, pembuatan dan interpretasi imunohistokimia dan analisis data. 3) Penyusunan laporan penelitian. Gambar 9. Jadwal penelitian H. Cara kerja Sampel mencit Balb/c betina usia 3-4 bulan berat badan 20-30 gram diambil sebanyak 21 ekor secara acak dengan metode simple random sampling kemudian dibagi menjadi tiga kelompok yaitu kelompok kontrol, kelompok pristan, dan kelompok pristan+secretome dengan masing-masing kelompok berisi 7 sampel. 1. Perlakuan: a. Kelompok kontrol: injeksi intraperitoneal NaCl 0,9% 0,5 ml. b. Kelompok pristan : injeksi intraperitoneal pristan 0,5 ml. c. Kelompok pristan+secretome : injeksi intraperitoneal pristan 0,5 ml dan secretome sel punca mesenkimal 0,45ml. Perlakuan pada hewan coba dilakukan sesuai dengan ethical clearance. Tata cara menyebabkan lupus pada mencit dilakukan dengan injeksi pristan 0,5 ml secara intraperitoneal sesuai dengan beberapa penelitian dan jurnal terdahulu. Pengorbanan mencit setelah perlakuan untuk diambil jaringan ginjal dilakukan secara syariat Islam tanpa menyiksa mencit dijelaskan pada lampiran 1. 2. Teknik pengambilan sampel dan penanganan spesimen: pada akhir minggu ketiga penelitian, dilakukan injeksi secretome 0,45 ml intraperitoneal dosis tunggal pada kelompok pristan+secretome dan injeksi NaCl 0,9% 0,45 ml intraperitoneal pada kelompok kontrol dan pristan. Pada hari ke 24 penelitian dilakukan pengorbanan mencit untuk diambil jaringan ginjal dilakukan secara syariat Islam tanpa menyiksa mencit dijelaskan pada lampiran. Pemeriksaan IL-17 dan TNF-α secara imunohistokimia adalah metode pemeriksaan pewarnaan jaringan berdasarkan kerja imunoenzim untuk memeriksa adanya atau mencari
26 lokasi antigen dalam spesimen. Imunohistokimia dilakukan berdasarkan interaksi antigen antibodi antara marker dan dengan antibodi primer. Dilakukan deteksi kromogenik berdasarkan warna yang timbul jaringan dan tingkat ekspresi IL-17 dan TNF-α dinilai secara kuantitatif dan dihitung sebagai nilai skor histologi. Teknik pewarnaan imunohistokimia merupakan pewarnaan imuno-peroksidase indirek menggunakan metode avidin biotin complex tiga fase dengan tahapan sebagai berikut: 1. Jaringan yang telah dibiopsi eksisi sehingga menjadi blok parafin kemudian dilakukan deparafinisasi sayatan jaringan untuk menghilangkan parafin dari jaringan. Deparafinisasi dilakukan dengan cara standar baku laboratorium, yaitu secara bertahap dengan waktu tertentu memasukkan preparat kedalam cairan aseton, xylol, alkohol 100%, alkohol 90%, alkohol 80%, alkohol 70% dan air. 2. Cuci jaringan menggunakan PBS ph 7,4 kemudian inkubasi jaringan dengan tripsin 0,125 % pada temperatur 37 0 C selama 5-10 menit, untuk membuka masking antigen. Jaringan diinkubasikan dengan H202 0,5% dalam metanol selama 30 menit untuk menghilangkan pewarnaan endogen, dibiarkan pada temperatur ruangan. 3. Cuci dengan air mengalir selama 1 menit, kemudian pencucian dengan akuadestilata.tandai jaringan dan cuci dengan PBS ph 7,4 selama 5 menit kemudian inkubasi dengan 3% serum yang dilarutkan dalam BSA 1% selama 20 menit kemudian cuci dengan PBS ph 7,4 sebanyak dua kali, masing-masing selama 3 menit. 4. Kemudian jaringan diinkubasi dengan monoklonal antibodi primer. Antibodi monoklonal dilarutkan dengan TRIS-PBS 1:200. Untuk jaringan seluas 1 cm 2 diperlukan 100 L antibodi monoklonal. Inkubasi dilakukan selama 30 menit dalam ruang lembab kemudian cuci jaringan dengan PBS ph 7,4 dua kali masingmasing selama 3 menit. 5. Inkubasi jaringan dengan antibodi primer yaitu antibodi anti murine yang telah dibiotinilisasi (Dako Kit). Lama inkubasi 30 menit selanjutnya cuci jaringan dengan PBS ph 7,4 dua kali masing-masing selama 3 menit.
27 6. Inkubasi jaringan dengan streptavidin-biotin peroksidase (Dako Kit) selama 30 menit kemudian jaringan dicuci dengan PBS ph 7,4 dua kali masing-masing selama 3 menit. 7. Inkubasi jaringan dengan substrat (Dako Kit) sampai timbul warna coklat pada jaringan, selama ± 15 menit kemudian cuci jaringan dengan PBS ph 7,4 dua kali masing-masing selama 3 menit. Warnai jaringan menggunakan Hematoksilin lalu jaringan dicuci dengan air mengalir. 8. Tutup jaringan dengan kaca penutup dan lem dengan entelan. Ekspresi molekul yang positip dengan antibodi monoklonal primer akan terlihat berwarna coklat dibawah mikroskop cahaya dalam skala pembesaran 400x. Dipilih lapang pandang yang paling banyak area positif kemudian dihitung jumlah area positif pada lima lapang pandang searah jarum jam. Tingkat ekspresi IL-17 dan TNF-α dinilai secara kuantitatif dan dihitung sebagai nilai skor histologi. Setiap pelaksanaan pewarnaan dibuat kontrol positif dan kontrol negatif. I. Teknik Analisis Data Data disajikan dalam bentuk mean ± SD kemudian dianalisis menggunakan SPSS 22 for windows dengan nilai p <0,05 dianggap signifikan secara statistik. Untuk mengetahui beda rata-rata antara kelompok kontrol, pristan dan pristan+secretome sel punca mesenkimal, digunakan uji F Anova dan dilanjutkan dengan LSD Post Hoc Test.
28 J. Alur Penelitian 21 ekor mencit Balb/C betina Umur 3-4 bulan, Berat badan ± 20-30 gr Randomisasi Injeksi NaCl 0,9% 0,5 ml Single injeksi Pristan 0,5 ml kontrol 7 ekor pristan 7 ekor pristan+secr etome 7 ekor 3 minggu 3 minggu 3 minggu Injeksi NaCl 0,9% 0,45 ml Inj. Secretome sel punca mesenkimal intraperitoneal 0,45 ml 72jam 72jam Sampel jaringan ginjal 72jam Analisis data Gambar 10. Kerangka operasional penelitian