DAFTAR ISI HALAMAN PENGESAHAN PERNYATAAN. KATA PENGANTAR DAFTAR ISI... DAFTAR GAMBAR.. DAFTAR TABEL.. DAFTAR LAMPIRAN... DAFTAR SINGKATAN INTISARI... ABSTRACT... BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang B. Keaslian Penelitian. C. Tujuan Penelitian D. Manfaat Penelitian.. ii iii iv vi viii x xi xii xv xvi 1 1 8 12 12 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA... A. Toxoplasma gondii... 1. Sejarah T. gondii 2. Klasifikasi.. 3. Morfologi... 4. Siklus hidup T. gondii... 5. Biologi molekuler.. B. Toksoplasmosis 1. Penularan dan patogenesis. 2. Toksoplasmosis kongenital 3. Gejala klinis 4. Diagnosis 14 14 14 15 17 21 25 26 27 29 34 35 vi
BAB III. 5. Pencegahan dan pengendalian 6. Pengobatan.. C. Loop-Mediated Isothermal Amplification (L-AMP) 1. Prinsip rancangan primer L-AMP.. 2. Reaksi L-AMP 3. Visualisasi hasil amplifikasi L-AMP.. D. Landasan Teori. E. Hipotesis... MATERI DAN METODE A. Materi B. Metode... 1. Produksi takizoit T. gondii.. 2. Isolasi DNA takizoit 3. Infeksi pada mencit dan pengambilan sampel 4. Isolasi DNA sampel melalui proses ekstraksi. 5. Isolasi DNA sampel tanpa melalui proses ekstraksi 6. Rancangan primer L-AMP.. 7. Amplifikasi DNA dengan metode L-AMP. 8. Amplifikasi DNA dengan PCR... 9. Uji sensitivitas. 10. Analisis hasil 11. Skema alur penelitian.. 37 38 39 40 42 45 46 50 53 54 55 58 59 60 61 62 62 63 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Rancangan Primer L-AMP... B. Amplifikasi dengan L-AMP dan PCR. C. Sensitivitas L-AMP dan PCR.. 64 67 73 86 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan... B. Saran. 93 93 93 RINGKASAN. 95 SUMMARY 101 DAFTAR PUSTAKA. 107 LAMPIRAN 120 vii
DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Diagram penelitian toksoplasmosis dengan metode L-AMP yang sudah pernah dilaporkan dan yang dikerjakan.. 11 Gambar 2. Morfologi tiga bentuk stadium infektif pada T. gondii... 11 Gambar 3. Morfologi oosista T. gondii, oosista yang belum bersporulasi dan oosista yang sudah bersporulasi... 18 Gambar 4. Morfologi takizoit T. gondii dari preparat apus cairan peritoneum mencit.. 20 Gambar 5. Morfologi sista T. gondii pada jaringan cerebellum mencit.. 21 Gambar 6. Siklus enteroepithelial T. gondii pada kucing 23 Gambar 7. Siklus hidup T. gondii pada hospes definitif maupun pada hospes intermedier.. 24 Gambar 8. Skema posisi masing-masing primer L-AMP pada target gen... 41 Gambar 9. Prinsip amplifikasi dalam metode L-AMP tahap non siklik.. 43 Gambar 10. Prinsip amplifikasi dalam metode L-AMP tahap siklik 45 Gambar 11. Gambar 12. Kotak hitung pada hemocytometer Neubauer untuk menghitung jumlah takizoit T. gondii. 53 Diagram proses isolasi DNA menggunakan PureLink TM Genomic DNA Mini Kit... 56 Gambar 13. Skema alur penelitian yang dilakukan 63 Gambar 14. Uterus mencit usia kebuntingan 7 hari yang diinfeksi dengan 10 3 takizoit T. gondii pada usia kebuntingan 4 hari.. 64 Gambar 15. Uterus mencit pada usia kebuntingan 7 hari, tanpa diinfeksi. 65 Gambar 16. Uterus mencit 5 hari sesudah infeksi dengan 10 3 takizoit T. gondii pada usia kebuntingan 9 hari... 65 viii
Gambar 17. Gambar 18. Hasil output BLASTN gen SAG-1 T. gondii isolat lokal IS- 1 (AY651825) dengan berbagai strain T. gondii 68 Lokasi masing-masing primer L-AMP yang dirancang dengan PrimerExplorer V4 pada gen SAG-1 isolat lokal dari data GenBank dengan Acc.no. AY651825... 71 Gambar 19. Elektroforesis hasil amplifikasi dengan L-AMP menggunakan rancangan primer dalam dengan penghubung tttt (A) dan tanpa penghubung tttt (B) pada 1,5% agarose. 72 Gambar 20. Gambar 21. Gambar 22. Gambar 23. Gambar 24. Gambar 25. Gambar 26. Gambar 27. Elektroforesis hasil amplifikasi dengan L-AMP dari sampel mencit perlakuan 5 hari sesudah infeksi pada agarose 1,5%, mengunakan rancangan primer dalam tanpa penghubung tttt berdasarkan gen SAG-1 isolat lokal... 75 Hasil amplifikasi dengan L-AMP dari sampel mencit perlakuan 5 hari sesudah infeksi mengunakan rancangan primer dalam tanpa penghubung tttt berdasarkan gen SAG-1 isolat lokal... 78 Visualisasi hasil reaksi L-AMP dengan penambahan SYBR green I dari sampel mencit perlakuan 5 hari sesudah infeksi mengunakan rancangan primer dalam tanpa penghubung tttt berdasarkan gen SAG-1 isolat lokal... 79 Elektroforesis hasil amplifikasi L-AMP mengunakan target gen SAG-1 isolat lokal dari sampel cairan amnion tanpa ekstraksi DNA 4-5 hari sesudah infeksi. 81 Hasil amplifikasi DNA dengan PCR sampel mencit perlakuan dua hari sesudah infeksi menggunakan primer spesifik gen surface antigen-1 T. gondii pada agarose 1,5%... 83 Hasil amplifikasi DNA dengan PCR sampel mencit perlakuan 3-5 hari sesudah infeksi menggunakan primer spesifik gen surface antigen-1 T. gondii pada agarose 1,5%... 84 Elektroforesis pada 1,5% agarose hasil uji sensitivitas L-AMP (A) dan PCR (B) pada sampel DNA takizoit 87 Elektroforesis pada 1,5% agarose hasil uji sensitivitas L-AMP (A) dan PCR (B) pada sampel DNA cairan amnion. 87 ix
Gambar 28. Gambar 29. Elektroforesis pada 1,5% agarose hasil uji sensitivitas dari sampel fetus (A) dan sampel plasenta (B) dengan L-AMP (panel 1) dan PCR (panel 2).. 88 Elektroforesis pada 1,5% agarose hasil uji sensitivitas L-AMP pada sampel DNA darah.. 89 x
DAFTAR TABEL Tabel 1. Tabel 2. Tabel 3. Primer L-AMP berdasarkan gen SAG-1 isolat lokal hasil rancangan dengan PrimerExplorer V4 69 Hasil pemeriksaan sampel darah induk, cairan amnion, fetus dan plasenta dengan metode L-AMP dan PCR dari mencit perlakuan 1-5 hari sesudah infeksi dengan takizoit T. gondii. 74 Hasil pemeriksaan sampel cairan amnion, fetus, dan plasenta tanpa melalui ekstraksi DNA dengan metode L-AMP dan PCR dari mencit perlakuan 1-5 hari sesudah infeksi dengan takizoit T. gondii. 80 xi
DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Lampiran 4. Lampiran 5. Lampiran 6. Lampiran 7. Lampiran 8. Analisis BLASTN sekuen kandidat primer luar (F3 dan B3) dengan berbagai strain Toxoplasma gondii... 120 Analisis BLASTN sekuen kandidat primer luar (F3 dan B3) dengan berbagai genom hospes. 122 Analisis BLASTN sekuen kandidat primer luar (F3 dan B3) dengan berbagai parasit lainnya 124 Parameter pada software PrimerExplorer V4 untuk merancang primer L-AMP 126 Rancangan primer luar dan primer dalam L-AMP mengunakan program PrimerExplorer V4.. 128 Rancangan primer loop pada L-AMP mengunakan program PrimerExplorer V4 129 Hasil rancangan primer L-AMP berdasarkan gen SAG-1 isolat lokal dengan program PrimerExplorer V4 130 Hasil pengukuran konsentrasi DNA dari berbagai sampel penelitian dengan spektrofotometer. 131 Lampiran 9. Konsentrasi masing-masing bahan dalam reaksi L-AMP... 132 xii