Kolokium Departemen Biologi FMIPA IPB: Ria Maria Ria Maria (G34090088), Achmad Farajallah, Maria Ulfah. 2012. Karakterisasi Single Nucleotide Polymorphism Gen CAST pada Ras Ayam Lokal. Makalah Kolokium Departemen Biologi FMIPA IPB, Bogor PENDAHULUAN Latar Belakang Indonesia memiliki banyak jenis ayam lokal yang semuanya disebut ayam kampung. Jenis-jenis ayam lokal Indonesia mempunyai potensi untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai bagian dari plasma nutfah, baik dari sisi kuantitasnya maupun dari sisi kualitasnya sebagai sumber gen dalam kerangka pemuliaan ayam. Pada tahun 2006 populasi ayam kampung mencapai 298,432 juta ekor. Pada tahun itu, sumbangan ayam lokal terhadap produksi daging sebesar 322,8 ribu ton atau 16% terhadap produksi daging secara Nasional dan terhadap daging unggas 31% (Dirjennak 2006). Saat ini terdapat beberapa jenis ayam lokal yang memiliki ciri spesifik dan berpotensi untuk dijadikan ternak unggas komersial ataupun dijadikan sumber gen untuk memperbaiki kualitas ayam-ayam komersial yang sudah ada. Nataamijaya (2000) mencatat beberapa jenis ayam lokal Indonesia, antara lain ayam pelung, ayam kedu, ayam nunukan, ayam sedayu, ayam sentul dan ayam gaok. Kualitas dan penerimaan konsumen dari produk unggas sebagian besar dipengaruhi oleh kualitas karkas atau daging, mulai dari penampilan, daya tahan air, tekstur sampai ke komposisi nutrien yang dikandungnya. Pada tingkat sel pertumbuhan hewan ternak dapat didefinisikan sebagai hyperplasia yaitu pertambahan jumlah sel melalui proses mitosis, dan hypertropi yaitu bertambahnya ukuran atau volume sel-sel otot (Hossner, 2005). Menurut Chung et al. (1999), kejadian hypertropi ini erat kaitanya dengan sistem calpain-calpastatin yang terdapat dalam jaringan tubuh. Calpain merupakan sebuah enzim proteolytic terkait dengan ion kalsium (Ca2+), yang ada dalam dua bentuk, yaitu μ-calpain dan m-calpain. μ-calpain merupakan calpain yang memerlukan ion Ca2+ dalam konsentrasi rendah, sedangkan m-calpain merupakan calpain yang memerlukan ion Ca2+ dalam konsentrasi tinggi. Calpain berfungsi untuk mendegradasi protein sel-sel otot (myofibril) di dalam jaringan otot (Goll et al., 1992). Selain μ-calpain dan m-calpain, dalam sistem calpain juga terdapat calpastatin (CAST). CAST ini merupakan inhibitor spesifik terhadap fungsi μ-calpain dan m-calpain. Morgan et al.(1993) melaporkan bahwa ketika aktivitas degradasi protein pada jaringan otot hewan hidup menurun, maka aktivitas CAST meningkat. Peningkatan aktivitas CAST menyebabkan terjadinya pertambahan massa otot (hyperthropy). Pemetaan lokus terkait dengan sifat kuantitatif (QTL) dan pencarian tipe DNA (alel) yang terkait dengan sifat unggul merupakan dasar penerapan program MAS (Marker Assisted Selection). Pendekatan melaui karakterisasi Single Nucleotide Polymorphism (SNP) dapat digunakan untuk mendeteksi sifat unggul dari seekor ternak dalam waktu yang relatif lebih cepat. Polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) adalah variasi dalam urutan nukleotida suatu gen. Variasi ini terjadi ketika sebuah nukleotida, menggantikan salah satu dari tiga lainnya. SNP ini cenderung relatif stabil pada suatu karakter atau gen sehingga SNP populer dijadikan sebagai penanda genetik. Walau begitu biasanya kejadian SNP harus dibuktikan keterpautannya dengan sifat yang ingin diamati terlebih dahulu. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristiasi polimorfisme nukleotida tunggal gen CAST pada beberapa ras ayam lokal. Waktu dan Tempat Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Januari 2013 sampai Juni 2013 di bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan Departemen Biologi, page 1 / 6
BAHAN DAN METODE Sampel Darah Ayam Ras Lokal. Darah dari sebanyak 60 terdiri dari 12 ras ayam lokal yang berasal dari berbagai daerah di Indonesia merupakan koleksi dari Maria Ulfah, S.Pt., MSc.Agr. Fakultas Peternakan IPB. Sampel darah (whole blood) diambil sebanyak 1-1,5 ml disimpan dalam alkohol 70 % dan ditambahkan 1 ml EDTA. Ekstraksi dan Isolasi DNA. Ekstrasi dan isolasi DNA berasal dari sel-sel darah ayam. Ekstraksi dan isolasi DNA akan menggunakan DNA Extraction Kit for animal blood (Geneaid). Amplifikasi Gen CAST. Amplifikasi ruas promotor gen CAST secara in vitro dilakukan menggunakan mesin PCR. Primer yang akan digunakan menurut penelitian Zhang et al. (2011), bagian forward: 5 -ACG CTA GGT GGA TCT GAA GAAG-3 dan reverse: 5 -AGG TAC TCT GGA GGG AGG CTAC-3. Reaksi PCR dilakukan dalam volume 25 ul yang terdiri atas sampel DNA 10-100 ng, masing-masing primer 1 ng, dntp 0.4 mm, MgCl2 0.2 mm dan Taq polimerase (RBC Canada) 0.75 unit beserta bufernya. Amplifikasi dilakukan pada suhu pra-denaturasi 92 C selama 10 menit; denaturasi pada suhu 94 C selama 1 menit, annealing pada suhu 58 C selama 1 menit dan pemanjangan pada suhu 72oC selama 2 menit yang dibuat 30 kali siklus; diakhiri dengan pemanjangan akhir pada suhu 72oC selama 10 menit. Metode Genotiping. Genotiping adalah kegiatan menentukan genotipe untuk ruas DNA yang ada dalam genom inti. Pada penelitian ini gen CAST diperbanyak fragmennya menggunakan dua teknik PCR yaitu RFLP dan SSCP. Pada teknik PCR-RFLP kondisi pemotongan mengikuti petunjuk produsen, yaitu 2 μl produk PCR dicampur dengan 1-2 unit enzim restriksi dalam 1 x bufer dan diinkubasi pada suhu 37 C selama semalam. Visualisasi fragmen DNA produk PCR yang telah dipotong dilakukan dengan teknik elektroforesis gel polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% yang diikuti dengan pewarnaan perak (silver staining). Teknik PCR-SSCP setelah amplifikasi DNA dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 94 C, penambahan formamida dye dan tahap elektroforesis gel poliakrilamida non denaturasi lalu pewarnaan perak sama seperti PCR-RFLP. Analisis Data. Data berupa frekuensi alel di setiap lokus dalam suatu populasi. Uji statistik kemudian dilakukan terhadap hasil-hasil perbandingan frekuensi alel antar lokus dan antar populasi. RENCANA PENELITIAN Kegiatan Bulan Pebruari Maret April Mei Juni Januari Studi Pustaka Ekstrasi dan Isolasi DNA Ampliikasi Gen CAST page 22/ /66 page
page 3 / 6
page 4 / 6
page 5 / 6