BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan dan Rumah Kaca University Farm, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dimulai dari bulan Mei sampai Desember 2009. Bahan dan Alat Bakteri endofit yang digunakan dalam penelitian ini diisolasi dari batang tanaman tomat sehat yang berada di wilayah Bogor, Cipanas dan Lembang. Sebagai pembanding dalam pengujian, digunakan isolat PGPR antara lain Pseudomonas fluorescens RH4003, Bacillus cereus L32 dan Bacillus Subtilis AB89, yang merupakan koleksi Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Ptoteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Selain itu, digunakan pula bakteri patogen Ralstonia solanacearum yang diisolasi dari tanaman tomat yang terserang layu bakteri pada areal pertanaman tomat di Bogor. Benih tomat yang digunakan untuk pengujian di lapangan yaitu varietas Arthaloka, yang disemai pada pot tray berukuran 30 cm x 50 cm dengan 50 lubang tanam, selanjutnya dipindah tanam pada polybag berdiameter 20 cm. Media tanam yang digunakan yaitu campuran antara pupuk kompos dan tanah steril dengan perbandingan 1:1. Metode Penelitian Isolasi dan pemeliharaan bakteri endofit Sumber bakteri endofit berasal dari tanaman tomat sehat yang berada di daerah Bogor, Cipanas dan Lembang. Sampel tanaman sehat yang dipilih yaitu yang berada diantara tanaman tomat yang terserang parah layu bakteri. Selanjutnya tanaman dibersihkan dengan air mengalir hingga bersih, dipotongpotong sepanjang 5 cm dengan memisahkan batang bagian bawah dan atas. Potongan batang tersebut kemudian disterilisasi permukaan dengan merendamnya dalam alkohol 70% selama satu menit, larutan NaOCl 2% selama tiga menit,
alkohol 70% selama tiga puluh detik, lalu dibilas dengan aquades steril sebanyak dua kali dan dikeringkan menggunakan kertas saring steril. Setelah batang kering, ujung-ujung batang dibakar dengan spirtus dan dipotong masing-masing sepanjang satu sentimeter pada kedua ujungnya. Bagian tengah dihaluskan pada mortar steril dan diencerkan dengan larutan buffer fosfat (PBS) sebanyak 5 ml. Suspensi kemudian diencerkan secara berseri hingga 10-5 dan dilakukan pencawanan (plating) secara duplo masing-masing sebanyak 50 μl pada media NA (Nutrient Agar). Setelah diinkubasikan pada suhu ruang selama 24-48 jam, koloni bakteri yang terbentuk masing-masing dipisahkan dan dipindahkan pada media cawan agar yang baru sehingga diperoleh isolat yang murni. Isolat bakteri endofit yang telah murni kemudian disimpan pada aquades steril pada suhu ruang untuk penyimpanan jangka pendek dan pada gliserol 20% dengan suhu -4 0 C untuk penyimpanan jangka panjang. Sebagai kontrol, batang yang belum dihaluskan digulirkan pada bagian tengah media NA dalam cawan petri dan diinkubasikan selama 24-48 jam. Hal ini dilakukan untuk menguji keefektifan sterilisasi permukaan. Jika terdapat kontaminasi maka bakteri hasil plating tidak dapat digunakan dan sterilisasi permukaan harus diulang (Gambar 1). a b Gambar 1 Hasil pengujian keefektifan sterilisasi permukaan dengan cara menggulirkan potongan batang pada permukaan medium NA; sterilisasi belum sempurna dengan adanya pertumbuhan bakteri (a), sterilisasi sudah sempurna (b)
Isolasi bakteri patogen (Ralstonia solanacearum) Bakteri patogen yang digunakan berasal dari areal pertanaman tomat yang terserang layu bakteri. Hal ini dimaksudkan agar bakteri patogen masih memiliki tingkat virulensi yang tinggi, karena masih fresh sehingga dapat memberikan hasil yang nyata pada saat pengujian. Ooze yang berasal dari bagian batang bawah (akar) yang dipotong kemudian disebar pada media TZC dalam cawan petri dan diinkubasikan selama 48 jam. Bakteri patogen kemudian disimpan pada suhu ruang dalam aquades steril dan dalam gliserol 20% pada suhu -4 0 C. Koloni patogen yang digunakan yaitu koloni tunggal berwarna merah muda dan dikelilingi lendir yang berwarna keputihan seperti pada Gambar 2. Gambar 2 Biakan murni R. solanacearum pada medium TZC; koloni tunggal yang virulen (tanda panah) bagian tengah berwarna merah muda dikelilingi lendir berwarna putih Peremajaan bakteri endofit, patogen, dan PGPR Sebelum digunakan untuk pengujian, bakteri endofit, patogen, dan PGPR diremajakan terlebih dahulu pada media King s B Agar. Penandaan bagi tiap calon bakteri endofit didasarkan atas daerah asal tanaman diambil dan bagian batang yang diambil ekstraknya. Bakteri PGPR berperan sebagai pembanding bagi bakteri endofit pada pengujian terhadap bakteri patogen. Agens pembanding ini berasal dari koleksi ketua peneliti yang diisolasi dari perakaran tomat dan disimpan dalam gliserol 20%. Bakteri-bakteri PGPR tersebut antara lain Pseudomonas fluorescens RH4003, Bacillus cereus L32 dan Bacillus subtilis AB89.
Penyiapan suspensi dan penentuan konsentrasi bakteri endofit, patogen, dan PGPR Bakteri yang disimpan dalam stok diremajakan pada media King s B Agar (KBA) dan diinkubasikan selama 24 jam. Setelah 24 jam, dibuat suspensinya dan dilakukan pengenceran berseri. Masing-masing hasil pengenceran diambil 100µl untuk diplating secara duplo pada media King s B Agar dan diinkubasikan selama 24 jam. Sisa hasil pengenceran diukur nilai absorbansinya dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 560-660 nm. Hasil plating yang telah diinkubasikan dihitung populasinya (jumlah koloni tunggal) agar diketahui kerapatan populasinya. Uji hipersensitif Uji hipersensitif bakteri endofit dilakukan untuk mengetahui patogenesitas bakteri endofit dengan menggunakan daun tembakau sehat. Suspensi bakteri endofit disuntikkan pada daun tembakau masing-masing sebanyak 2 ml dengan tiga kali ulangan untuk setiap bakteri endofit. Kemudian diinkubasi selama 24 jam sampai 48 jam dan dilakukan pengamatan terhadap perubahan yang terjadi pada daun tembakau. Bakteri yang menunjukkan reaksi negatif yaitu tidak timbul gejala nekrosis dapat digunakan untuk pengujian selanjutnya. Uji antagonis secara in vitro Pengujian dilakukan dengan metode dual culture dan dalam dua tahap. Tahap pertama yaitu dengan melihat zone hambatan yang dihasilkan bakteri endofit pada media King s B Agar yang mengandung Ralstonia solanacearum. Tahap kedua, bakteri endofit yang tidak menghasilkan zone hambatan diuji pada media King s B cair 10% yang mengandung Ralstonia solanacearum. Pada tahap pertama, media KBA yang belum padat dengan suhu 50 0 C sampai 55 0 C dicampurkan dengan 1 ml suspensi Ralstonia solanacearum lalu divortex dan dituang pada cawan petri. Setelah padat, kertas saring steril yang telah dicetak berbentuk bulatan kecil diletakkan pada bagian tengah media, ditetesi dengan suspensi bakteri endofit sebanyak 20 ul dengan kerapatan 10 8-10 9 cfu/ml. Tiap isolat bakteri endofit diuji sebanyak dua kali (duplo). Sebagai
kontrol, di atas kertas saring diteteskan aquades steril sebanyak 20 ul. Sedangkan untuk pembanding, diteteskan bakteri PGPR masing-masing sebanyak 20 ul. Kemudian diinkubasikan selama 24 jam sampai 48 jam. Zona bening yang terbentuk lalu diukur panjang diameternya. Bakteri endofit yang tidak menghasilkan zona bening kemudian diuji dengan King s B cair (KBB) 10%. Sebanyak 50 ml KBB 10% ditambahkan 1 ml suspensi bakteri endofit dan 1 ml suspensi Ralstonia solanacearum. Sebagai kontrol, dicampurkan 1 ml aquades steril dan 1 ml suspensi Ralstonia solanacearum. Kemudian, diinkubasikan pada suhu ruang dan digoyang pada rotary shaker selama 24 jam. Hasil inkubasi diencerkan secara berseri dengan metode longkang, yaitu hanya pengenceran genap saja (10-4, 10-6, 10-8 ) yang diplating secara duplo pada media KBA dan diinkubasikan selama 24 jam. Setelah masa inkubasikan, dilakukan perhitungan populasi Ralstonia solanacearum. Bakteri endofit yang mampu melakukan penekanan paling baik terhadap Ralstonia solanacearum dan membentuk zone hambatan paling besar akan digunakan pada pengujian secara in planta. Uji in planta Pengujian secara in planta untuk melihat peran bakteri endofit dalam memacu pertumbuhan tanaman (PGPR) dan kemampuannya menekan kejadian penyakit layu bakteri oleh Ralstonia solanacearum (sebagai agens antagonis). Pada pengujian pertama, media tanam pada polybag tidak diinfestasikan R.solanacearum. Digunakan satu tanaman untuk tiap bakteri endofit dan diulang sebanyak sepuluh kali. Sedangkan pada pengujian kedua, media tanam pada polybag diinfestasikan R. solanacearum sebanyak 50 ml untuk tiap polybag dan digunakan 10 tanaman uji untuk setiap pelakuan dengan tiga kali ulangan. Terdapat tujuh macam perlakuan, enam diantaranya menggunakan bakteri endofit dan sebagai kontrol menggunakan aquades steril. Adapun tahapannya sebagai berikut : 1. Persiapan media tanam dan tanaman uji Media tanam berupa tanah dan kompos dengan perbandingan 1:1 disterilisasi terlebih dahulu. Tanaman tomat varietas Arthaloka ditanam
pada pot tray berukuran 30 cm x 50 cm dengan jumlah lubang tanam sebanyak 60 lubang. Media tanam yang sudah steril diisikan ke dalam pot tray untuk kemudian ditanami benih tomat Arthaloka sebanyak empat benih (biji) per lubang tanam. Bibit yang telah berumur satu minggu setelah tanam (MST) kemudian dicabut, dibersihkan akarnya, dan direndam pada suspensi bakteri endofit dan aquades steril untuk kontrol selam 12-14 jam untuk kemudian dipindahtanamkan ke polybag berukuran 1 kg. Polybag diisi dengan media tanam steril sekitar 500 gr atau kira-kira ½ dari tinggi polybag, 250 gr di atasnya media tanam yang terinfestasi patogen Ralstonia solanacearum, dan ditimbun dengan 250 gr media tanam steril setelah dilakukan pindah tanam. 2. Persiapan suspensi bakteri patogen dan endofit Bakteri patogen yang digunakan dalam pengujian kejadian penyakit (KP) berjumlah enam bakteri dan aquades steril sebagai kontrol. Tiga macam bakteri dari hasil pengujian zona bening dengan kriteria panjang diameter zona bening yang lebih besar, pertumbuhan bakteri yang baik dan cepat, serta berwarna khas. Ketiga bakteri yang lainnya berasal dari pengujian penghambatan patogen dengan media cair. Adapun kriteria yang dipilih yaitu mampu memberi penekanan yang besar terhadap pertumbuhan patogen, berwarna khas, dan bakteri endofit tersebut tumbuh sangat baik dan cepat. Suspensi bakteri endofit dan Ralstonia solanacearum yang digunakan untuk perlakuan memiliki kerapatan 10 9-10 10 cfu/ml. Suspensi patogen yang telah dishaker kemudian diencerkan sebanyak 10-1 dan dicampurkan pada tanah steril secara merata sebanyak 50 ml untuk tiap polybag. Sedangkan suspensi bakteri endofit digunakan untuk perendaman bibit sebelum pindah tanam masing-masing direndam dalam suspensi bervolume 50 ml/bakteri endofit, serta untuk penyiraman sesaat setelah pindah tanam dengan volume masing-masing 50 ml/tanaman. Suspensi ini sebelumnya diencerkan terlebih dahulu sebanyak 10-1. Bakteri endofit yang digunakan antara lain AC 1, BC 4, BC 5, BC 10, BL 10, dan BL 17.
3. Perlakuan dan pindah tanam Bibit yang berumur kurang lebih satu minggu setelah tanam (MST) direndam dengan suspensi bakteri endofit masing-masing 50 ml/bakteri endofit selama 12-14 jam kemudian dipindahtanamkan pada media tanam yang berada pada polybag. Media tanam steril digunakan untuk perlakuan tinggi dan bobot tanaman, sedangkan media tanam yang mengandung R. solanacearum untuk pengujian kejadian penyakit (KP). Bibit yang telah dipindahtanamkan lalu disiram dengan suspensi bakteri endofit sesuai perlakuan masing-masing sebanyak 50ml/tanaman. Setelah itu, dilakukan pengamatan kejadian penyakit (KP) dan pemacu pertumbuhan (tinggi tanaman dan bobot basah) setiap minggunya. Jika kejadian penyakit pada salah satu perlakuan sudah menduduki posisi teratas (paling banyak) untuk ketiga ulangannya maka pengamatan dihentikan dan pada saat itu bobot basah tanaman pada pengujian pemacu pertumbuhan ditimbang. Jumlah tanaman yang digunakan pada pengujian kejadian penyakit yaitu 10 tanaman/perlakuan dengan tiga kali ulangan dan satu tanaman untuk perlakuan pemacu pertumbuhan dengan ulangan sebanyak sepuluh kali. Kejadian penyakit (KP) dapat dihitung dengan rumus : KP = (n/n) x 100% Keterangan : KP = kejadian penyakit layu bakteri pada tanaman tomat n = jumlah tanaman yang terserang patogen N = jumlah tanaman uji untuk tiap ulangan Karakterisasi bakteri endofit Pengujian terhadap sifat-sifat fisiologi dan biokimia dilakukan pada empat macam bakteri endofit (AC1, BC4, BL10 dan BL17) sampai tingkat genus dan spesies di Laboratorium Bakteriologi Hewan, Departemen Kedokteran Hewan, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Analisis data Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan kelompok sebagai ulangan. Kemudian data yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (anova) dengan menggunakan program Statistical Analysis System (SAS) versi 9.0 dan dilanjutkan uji DMRT dengan taraf nyata 5%. Nilai dugaan untuk data hilang diperoleh dengan rumus sebagai berikut (Gomez & Gomez 1995). X = rbo + tto Go (r-1)(t-1) Keterangan : X = dugaan data yang hilang t = banyaknya perlakuan r = banyaknya ulangan Bo = jumlah nilai pengamatan dari ulangan dimana terdapat data yang hilang To = jumlah nilai pengamatan dari perlakuan dimana terdapat data yang hilang Go = jumlah umum dari semua pengamatan