III. METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Hutan dan rumah kaca Puslitbang Hutan dan Konservasi Alam (P3HKA) Gunung Batu Bogor. Percobaan dilaksanakan selama sepuluh bulan, mulai bulan November 2007 sampai bulan Agustus 2008 3.2 Bahan dan Alat Bahan pengomposan yang digunakan antara lain : kompos serbuk gergaji dari berbagai jenis tanaman yang dicampurkan dengan tanah gambut (peat) basah dari bawah tegakan hutan alam pontianak. Bahan pembenah tanah : Arang kayu campuran berbentuk bubuk didapatkan dari laboraturium kimia Pemanenan BP3H Gunung Batu; bubuk batubara merupakan bubuk/debu sisa batubara yang telah tidak terpakai didapatkan dari Kabupaten Tanjung-Tabalong Kalimantan Selatan Tanaman uji yang digunakan terdiri dari tiga jenis yaitu : A. crassna (Gaharu) diunduh dari kebun koleksi BP3H di Darmaga, benih Calophyllum sp. dan Palaquium sp. diunduh dari jenis yang tumbuh pada lahan gambut Kalimantan Tengah. Inokulum FMA yang digunakan terdiri dari dua jenis : Glomus etunicatum dan Gigaspora margarita yang telah diisolasi dan dikembangkan oleh Laboraturium Mikrobiologi BP3H Gunung Batu. Alat yang digunakan sesuai dengan tahapan penelitian yang dilakukan yaitu: Peralatan pengomposan dan penanaman, meliputi : plastik hitam, karung, sekop, cangkul, gembor, thermometer, polybag dan sarang, bak kecambah, kaliper, penggaris besi. Peralatan uji bakteri dan mikoriza, meliputi : saringan spora, pinset, sentrifuge, tabung reaksi, neraca analitik, ph meter, oven, mikroskop binokuler Peralatan tulis dan dokumentasi
3.3 Metode Penelitian Penelitian ini disusun menggunakan rancangan percobaan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan penempatan unit contoh berdasarkan jenis tanaman uji. Faktor perlakuan terdiri atas penambahan pembenah tanah dengan empat taraf perlakuan dan inokulasi FMA sebanyak tiga taraf perlakuan dengan lima belas ulangan. Susunan perlakuan adalah sebagai berikut : 1. Faktor penambahan pembenah tanah o Sg = kompos serbuk gergaji 100 % o SgA = kompos serbuk gergaji 90% + arang 10% o SgB = Kompos serbuk gergaji 90% + batubara 10% o SgBA = kompos serbuk gergaji 80% + batubara 10% +arang 10% 2. Faktor inokulasi CMA o M0 = tanpa mikoriza o M1 = Glomus etunicatum o M2 = Gigaspora margarita Model statistik yang digunakan adalah : Yijk = µ + Si + Mj + (SM)ij + εijk Keterangan : i : 1,2,3,4 j : 1,2,3 Yijk = nilai pengamatan faktor S (pembenah tanah) ke-i, faktor M (mikoriza) ke-j, ulangan ke-k Si = pengaruh penambahan pembenah tanah ke-i Mj = pengaruh jenis mikoriza ke-j (SM)ij = komponen interaksi Faktor S ke-i dengan faktor M ke-j εijkl = pengaruh acak untuk menentukan perbedaan dilakukan analisa lanjutan dengan DMRT pada taraf 95%, data dianalisis menggunakan sofware aplikasi MINITAB ver. 14.
3.4 Tahapan Kegiatan Pembuatan Kompos Serbuk Gergaji a. Penyiapan serbuk gergaji dicampur gambut dengan perbandingan 99% serbuk gergaji dan 1% gambut (peat) dicampur hingga merata. Campuran Serbuk gergaji ini ditambahkan larutan NH 4 OH 2% (digunakan urea yang mempunyai bahan aktif 45% NH 4 OH) dan ditambahkan air hingga kelembaban mencapai 80%. Disimpan dalam kondisi anaerob selama 1 minggu (ditutup dengan plastik hitam). b. Perlakuan pengayaan pembenah tanah ditambahkan sejak masa pencampuran pembuatan kompos, yaitu : a) Serbuk gergaji 100% b) Serbuk gergaji 90% + arang 10% c) Serbuk gergaji 90% + batubara 10% d) Serbuk gergaji 80% + batubara 10% + arang 10% Pada masing-masing perlakuan ditambahkan 2% NH 4 OH disimpan dalam kondisi anaerob selama 1 minggu. c. Masing-masing campuran ditambahkan sukrosa + 2% larutan NH 4 OH dan ditambahkan bakteri penambat nitrogen, diaduk merata agar aerasi terjaga dan bakteri dapat bekerja dengan optimal. Disimpan kembali dalam kondisi anaerob selam 1 minggu. Proses dekomposisi terhadap bahan oleh mikroorganisme mikro dapat berjalan sempurna maka kelembaban, dan aerasi perlu diperhatikan. Proses pembalikan dan pencampuran media dilakukan sedemikian rupa hingga merata sampai 4 minggu. Penanaman Bibit Tanaman (persemaian) a. Penyiapan media tanam semai Kompos serbuk gergaji pada masing-masing perlakuan dicampurkan dengan tanah yang telah disterilisasi dengan perbandingan 1:1 sebagai media tanam. Media tanam tersebut dimasukkan ke dalam polybag ukuran 10 x 15 cm dimana masing-masing perlakuan diulang sebanyak lima belas
tanaman sehingga setiap jenis tanaman membutuhkan 180 polybag dan dan total polybag yang digunakan adalah 540 buah. b. Perkecambahan Tanaman Uji Benih A. crassna dicuci untuk menghilangkan kotorannya kemudian dijemur sebentar (±2-3 jam) dan ditabur pada bak kecambah dengan media zeolit steril dan ditutup dengan pasir halus steril. Sedangkan Calophyllum sp. dan Palaquium sp. dicuci terlebih dahulu untuk menghilangkan kotoran dan langsung ditabur pada bak kecambah dengan media tanah steril. Perkecambahan dilakukan 2 minggu sebelum penanaman. c. Aplikasi mikoriza Dua jenis endomikoriza yang digunakan merupakan hasil pengembangan dari Lab. Mikrobiologi Badan Litbang Kehutanan yaitu Glomus etunicatum dan Gigaspora margarita. Inokulum mikoriza diberikan bersamaan dengan waktu penyapihan bibit ke dalam polybag sebanyak 5 g dengan jumlah spora rata-rata 4.1. d. Penyapihan dan Pemeliharaan Penyapihan kecambah dari bedeng tabur ke polybag dilakukan setelah semai memiliki 2-3 daun. Pada saat penyapihan dilakukan seleksi dengan melihat bentuk kecambah yang berbatang lurus dan seragam. Tinggi tanaman uji yang disapih untuk tiap jenis berbeda-beda, A. crassna disapih dengan rata-rata ketinggian 5 cm sedangkan Calophyllum sp. dan Palaquium sp. disapih dengan rata-rata tinggi 8 cm. Setelah penyapihan tanaman disiram dan ditempatkan dalam rumah kaca sesuai layout percobaan. Pemeliharaan yang dilakukan adalah penyiraman dan pembersihan dari gulma secara rutin setiap hari secara manual. Pewarnaan Akar Metode pewarnaan akar menggunakan metode yang dikembangkan oleh Brundrett et al. (1996) dengan berbagai modifikasi. a. Akar semai yang telah dibersihkan dipotong-potong, dimasukkan ke tabung berisi KOH 2.5% selama 24 jam hingga terlihat jernih
b. Jika akar belum jernih, KOH dibuang kemudian akar dimasukkan dalam larutan H 2 O 2 10% sebanyak 5-10 ml dan dibiarkan hingga akar jernih (± 10-15 menit) c. Akar dicuci bersih dan direndam dengan larutan 0.1 N HCL selama 10 menit d. Kelebihan larutan HCl dibuang, ditambahkan larutan pewarna yang terdiri atas Trypan blue 0.02% + glycerol 70% + aquadest 30% selama 24 jam e. Akar dicuci kembali dengan air mengalir dan direndam dalam larutan Glyserol 50% Diversitas Mikroba a. Pembuatan media NA : Ditimbang NA sebanyak 2.3 g dan agar 0.5 g dicampurkan dan dilarutkan dalam 100 ml aquadest, dipanaskan sambil diaduk, setelah mendidih dan homogen media disterilisasi dalam autoclaf pada suhu 121 C selama 15 menit. Ketika telah hangat kuku media dituang dalam petri steril 1-2 ml, didinginkan. Setelah padat petri disimpan terbalik agar uap tidak jatuh ke permukaan media. b. Isolasi mikroba: Isolasi dilakukan dengan metode cawan tuang untuk pembiakan bakteri sebab metode ini memungkinkan pertumbuhan semua jenis bakteri yang ada baik bakteri aerob maupun anaerob. Metode cawan tuang : kompos sebanyak 1 g dilarutkan dalam 10 ml air steril kemudian diaduk rata. Supernatan yang didapatkan diencerkan hingga dari 10 1 hingga 10 6. Media NA yang telah hangat kuku dituang dalam cawan petri kemudian supernatan (dicampurkan) sebanyak 100 µl. Prosedur ini dilakukan secara aseptik. Masing-masing cawan petri diinkubasikan dengan posisi terbalik pada suhu kamar selama 24-72 jam. c. Pengamatan dilakukan setiap hari dengan menghitung jumlah koloni mikroba yang tumbuh pada media.
3.5 Pengukuran dan Analisis Parameter yang diamati adalah: a. Tinggi tanaman, diukur setiap dua minggu selama 14 minggu. Diukur dari leher akar sampai titik tertinggi semai pada pucuk batang, pengukuran pertama dilakukan 2 minggu setelah tanam (2 mst) b. Diameter batang, diukur setiap dua minggu selama 14 minggu pada 1 cm dari leher akar dan ditandai, pengukuran pertama dilakukan 2 minggu setelah tanam c. Berat kering tanaman (bagian atas dan bagian bawah tanaman) Contoh tanaman setelah dibersihkan, dipotong pada bagian leher akar (yang ditandai), dioven pada suhu 70 C selama 48 jam dan ditimbang. dilakukan diakhir penelitian. d. Nisbah pucuk akar (membandingkan berat kering pucuk dan berat kering akar) e. Indeks mutu bibit (IMB) Kualitas bibit dihitung dengan menggunakan rumus kualitas indeks Dickson et al. (1960) : Berat kering total Indeks mutu bibit = (tinggi (cm)/diameter (mm)) + (berat kering pucuk (g)/berat kering akar (g)) bibit yang baik dan akan mampu bertahan dilapangan jika memiliki nilai IMB>0.09 f. Kolonisasi FMA Kolonisasi FMA diukur dengan metode yang dikembangkan oleh Brundrett et al. (1996) pada akhir penelitian. Prosedur : Mengambil secara acak potongan akar yang telah diwarnai sepanjang 1 cm dan menyusun pada kaca obyek, satu slide untuk 10 potongan akar Mengamati kolonisasi FMA berupa vesikel, arbuskula internal hifa dan mencatat potongan akar yang terkolonisasi
Persentase akar yang terkoloni FMA dihitung berdasar rumus %kolonisasi= bidang pandang contoh akar yang terkoloni x 100% total bidang pandang contoh akar g. Derajad Ketergantungan (MD) Plenchette et al. (1983) MD (%) = BKT tanaman bermikoziza BKT tanaman tanpa mikoriza x 100 % BKT tanaman bermikoriza h. Analisis media tanam pada masing masing perlakuan (ph, N-total, C- organik, P-tersedia, KTK) i. Analisis jaringan untuk serapan P dan N j. Diversitas keragaman mikroba pada kompos serbuk gergaji plus yang diperkaya pembenah tanah setelah digunakan sebagai media semai.