III. METODE PENELITIAN A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian Materi yang diteliti adalah ikan nilem ( Osteochilus hasselti C. V.), pada tahap perkembangan juvenil berumur 13 minggu dengan panjang tubuh 45-65 mm (hasil pemijahan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan Hewan) sebanyak 144 ekor. 2. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian telah dilakukan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan Hewan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto. Penelitian dilaksanakan mulai bulan Mei 2014 sampai dengan bulan Oktober 2014. B. Rancangan Percobaan Penelitian dilaksanakan secara eksperimental dengan Rancangan Acak Lengkap pola Faktorial. Faktor pertama posisi amputasi terdiri atas empat taraf N1: kontrol, N2: pangkal, N3: pertengahan antara cagak dan pangkal, N4: cagak. Faktor kedua adalah pakan berkadar protein berbeda terdiri atas tiga taraf yaitu P1: 33%, P2: 35%, dan P3: 42%. Jumlah kombinasi perlakuan sebanyak 12, pada setiap perlakuan disediakan 3 unit ulangan. Variabel yang diamati terdiri dari variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebas adalah posisi amputasi dan kadar protein pakan. Variabel tergantung berupa regenerasi sirip juvenil ikan nilem pasca amputasi dengan parameter pertambahan panjang dan luas sirip pada daerah amputasi dan data kualitatif berupa struktur histologis jaringan sirip yang baru. Tabel 3.1. Kombinasi Perlakuan antara Posisi Pemotongan dengan Kadar Protein dalam Pakan Posisi amputasi ( N ) Protein Pakan ( P ) N1 N2 N3 N4 P1 P1N1 P1N2 P1N3 P1N4 P2 P2N1 P2N2 P2N3 P2N4 P3 P3N1 P3N2 P3N3 P3N4
C. Cara Kerja 1. Pemijahan dan Penyediaan Ikan Uji Induk ikan Nilem jantan dan betina yang matang gonad disiapkan, keduanya diinduksi menggunakan ovaprim 0,5 ml/kg berat badan. Induk betina dan jantan diletakkan pada bak pemeliharaan berukuran 50 cm x 45 cm x 35 cm selama 6-8 jam, kemudian induk jantan dan betina dipisahkan. Selanjutnya induk jantan distripping untuk mengeluarkan milt, sedangkan induk betina distripping untuk mengeluarkan sel telur. Fertilisasi dilakukan dengan cara mencampurkan milt dan sel telur kedua induk di dalam piring cawan kecil dengan akuades untuk aktivasi spermatozoa. Setelah terjadi kontak antara milt dan sel telur kemudian campuran ini dimasukkan ke dalam bak pemeliharaan berukuran 50 cm x 45 cm x 35 cm. Larva hasil fertilisasi kemudian dipelihara selama 12 minggu di bak pemeliharaan sampai tahap juvenil dengan diberi pakan dua kali sehari pukul 09.00 dan 15.00 menggunakan pakan ikan komersil dengan kandungan protein 41% dan lemak 6%. 2. Persiapan Bak Pemeliharaan Bak pemeliharaan berukuran 20 l, dibersihkan terlebih dahulu dengan air, kemudian diisi air sebanyak 18 l dan diberi aerasi untuk mempertahankan kandungan oksigen terlarut dalam air. Disiapkan 36 buah bak pemeliharaan berukuran 35 cm x 25 cm x 20 cm yang masing-masing diisi larva 12 minggu sebanyak 4 ekor. 3. Pengukuran Panjang dan Penimbangan Bobot Ikan Uji Panjang tubuh diukur menggunakan kertas millimeter blok dengan ketelitian 1 mm dan bobot tubuh ikan uji ditimbang menggunakan timbangan analitik dengan ketelitian 0,01 g. Bobot ikan uji setiap bak pemeliharaan diukur untuk menentukan jumlah pakan yang diberikan. 4. Pemotongan Sirip dan Pemeliharaan Ikan Uji Proses pemotongan sirip diawali dengan pengukuran panjang total ikan menggunakan milimeter blok, kemudian dilakukan pemotongan sirip pada bagian sirip ekor dengan tiga posisi pemotongan yang berbeda dimulai dari bagian 11
pangkal, pertengahan antara pangkal dan cagak, cagak (Gambar 3.1. -3.3.), dan pengukuran panjang sirip yang dipotong. Gambar 3.1. Posisi Amputasi pada Pangkal Sirip Ekor Gambar 3.2. Posisi Amputasi pada Pertengahan Pangkal dan Cagak Sirip Ekor Gambar 3.3. Posisi Amputasi pada Batas Cagak Sirip Ekor Setelah proses pemotongan sirip, ikan dipelihara selama 5 minggu dengan diberi pakan dua kali sehari pukul 09.00 dan 15.00 yang berkadar protein berbeda, yaitu 33%, 35%, 42% sebanyak 5% dari berat biomassa ikan (Melianawati dan Suwirya, 2010). 12
5. Pengambilan data dan Evaluasi Pertumbuhan Sirip Regeneratif Secara Makroskopis Data penelitian berupa perkembangan sirip ekor pada juvenile ikan nilem paska amputasi yang diukur setiap 7 hari sekali. Pengukuran pertambahan panjang dan luas pada bagian sirip ekor dilakukan menggunakan mikroskop stereo dengan bantuan eye piece micrometer yang telah dikalibrasi dan bentuk sirip hasil regenerasi didokumentasikan melalui foto. Disamping pengukuran panjang sirip juga diamati struktur histologis sirip yang beregenerasi dan struktur histologis didokumentasikan dalam bentuk foto. 6. Evaluasi Pertumbuhan Sirip Regeneratif Secara Mikroskopis Evaluasi pertumbuhan sirip regeneratif pada ikan uji secara mikroskopis dilakukan dengan dua metode, seperti dijelaskan dibawah ini. 6.1. Pembuatan Sediaan Histologis Sirip dengan Metode Parafin (Suntoro, 1983; yang telah dimodifikasi oleh Laboratorium Struktur dan Perkembangan Hewan, Fakultas Biologi Unsoed). Sirip yang telah difiksasi dalam Normal Buffered Formalin (NBF) kemudian didehidrasi dalam larutan alkohol bertingkat dari alkohol 70% hingga alkohol absolut, didealkoholisasi dalam larutan alkohol:xylol dan xylol, diinfiltrasi dalam larutan xylol:parafin dan parafin murni, serta ditanam dalam parafin. Pengirisan jaringan dalam blok parafin dilakukan menggunakan rotary microtome dengan ketebalan 4 µm. Irisan jaringan ditempel pada object glass yang sudah dilapisi gelatin 1% akuosa dan dikeringkan pada suhu ruang. Irisan dideparafinisasi kemudian diwarnai dengan pewarna Carrazzi s Hematoxylin-Eosin dan Alizarin Red. Cara kerja pembuatan sediaan histologis secara rinci dijelaskan pada Lampiran 2. 6.2. Evaluasi Sediaan Histologis Tahapan regenerasi sirip diawali dengan proses penutupan luka oleh lapisan epitel, kemudian blastema terbentuk melalui proses dedifferentiation dan bergerak ke bagian epitel untuk menutup luka. Fase berikutnya dari regenerasi ditandai dengan deposisi tulang (Atta et al., 2013). Struktur histologis pada proses regenerasi sirip setelah amputasi dievaluasi berdasarkan terbentuknya lapisan epidermal berlapis banyak, migrasi sel mesenchym distal ke bagian yang diamputasi, proliferasi sel mesenchym 13
untuk membentuk blastema, diferensiasi blastema pada bagian distal untuk membentuk sirip baru (Böckelmann dan Bechara, 2009). D. Metode Analisis Data pertambahan panjang dan luas sirip hasil regenerasi ditabulasi kemudian dianalisis menggunakan Anova dua arah. Hasil Anova menunjukkan berbeda nyata pada p<0,05, maka analisis dilanjutkan dengan uji Post hock. Data histologis perkembangan sirip dianalisis secara deskriptif. 14