BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Teh dan Kina (PPTK) Bandung untuk membuat teh hijau dan teh daun murbei; dan menganalisis kimia teh daun murbei dan teh hijau+teh daun murbei. Kemudian dilanjutkan di Laboratorium Seafast Center, Institut Pertanian Bogor, untuk melihat pengaruh pemberian minuman teh terhadap kadar glukosa darah tikus diabetes mellitus. Persiapan ransum dan analisis kadar air ransum dilakukan Laboratorium Departemen Gizi Masyarakat, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Juli 2007 sampai Juni 2008. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian meliputi bahan utama, antara lain: Teh Camellia sinensis klon Gambung 7 dan 9. yang didapatkan dari laboratorium Pusat Penelitian Teh dan Kina (PPTK) Bandung, daun murbei Morus kanva dan multikaulis yang didapatkan dari Lembaga Masyarakat Disekitar Hutan (LMDH) Sukamanah, Bandung., Alloksan dari Sigma (A7413-10G) untuk membuat tikus normal jadi diabetes. Peralatan yang digunakan adalah timbangan berat badan (BB) tikus, glukometer (One Touch Ultra) untuk pengukuran kadar glukosa darah, spuit untuk menyuntikan alloksan, dan Sonde untuk mencekokan minuman.
18 (a) (b) 01000900000378000 00002001c00000000 00040000000301080 0050000000b020000 0000050000000c02b a076d03040000002e 0118001c000000fb02 1000070000000000b c0200000000010202 2253797374656d000 76d030000e00e0000 783b120026e27405f 84c17000c02000004 0000002d0100001c0 00000fb029cff00000 00000009001000000 000440001254696d6 573204e657720526f (c) 6d616e00000000000 00000000000000000 000000040000002d0 10100040000000201 01000500000009020 00000020d00000032 0a5a00ffff010004000 00000006b03bd0720 4d2d00040000002d0 10000030000000000 (d) Gambar 4. Peralatan penelitian (a) One Touch, (b) Alloxan Monohydrat, (c) Timbangan BB tikus, (d) spuit dan sonde. Metode Penelitian Penyiapan Bahan Uji Sebanyak 20 gram teh hijau, 20 gram teh daun murbei, dan 20 gram campuran teh hijau dan teh daun murbei (campuran 1:1), masing-masing bahan diseduh dengan cara direndam menggunakan air panas (70 0 C 80 0 C) sebanyak 200 ml selama ±15 menit, kemudian disaring dan diambil filtratnya. Asumsi yang digunakan adalah teh hijau mengandung katekin 10% dari berat kering. Hewan Percobaan Sebanyak 30 ekor tikus putih jantan jenis Sprague Dawley umur 8 minggu digunakan dalam penelitian ini. Semua tikus dipelihara terlebih dahulu kurang
19 lebih 7 hari untuk penyesuaian lingkungan. Tikus dikandangkan dengan pengaturan suhu (22 0 C) dan kelembaban (55%). Ruangan dikontrol dengan siklus 12 jam penerangan dan 12 jam gelap (Kim et al. 2006). Pembuatan Ransum Tikus diberi pakan standar laboratorium yaitu: protein (10% kasein), lemak (8% minyak jagung), mineral mix (5%), vitamin mix (1%), serat (selulosa 1%), dan karbohidrat (pati tapioka) sampai 100%. Air dan pakan diberikan ad libitum selama masa penelitian (AOAC 1990) Tikus dibuat menjadi Diabetes dengan Induksi Alloksan Setelah melewati masa adaptasi, sebanyak 20 ekor tikus dibuat menjadi diabetes dengan diinduksi menggunakan alloksan monohidrat, induksi dilakukan dengan injeksi secara intraperitonial, dosis alloksan yang digunakan sebanyak 120 mg/kg BB. Tikus yang diinduksi tetap diberi makan dan minuman ad libitum. Dua hari setelah penyuntikan, kadar glukosa darah tikus diukur. Tikus dengan kadar glukosa darah 200 mg/dl dikategorikan diabetes dan siap untuk digunakan dalam penelitian ini (Kim at al. 2006). Tingkat keberhasilan untuk membuat tikus normal menjadi diabetes dengan induksi alloksan ±80 persen. Bila 5 hari setelah disuntik belum terjadi diabetes maka dilakukan penyuntikan kembali. Pengujian Pengaruh Minuman Teh Pengujian dibagi dalam empat tahapan penelitian yaitu: tahap pertama untuk penentuan bahan baku minuman teh yang terbaik, tahap kedua untuk menentukan turnover kadar glukosa darah tikus normal, tahap ketiga untuk melihat pengaruh minuman teh terhadap kadar glukosa darah tikus diabetes selama 120 menit, dan tahap keempat untuk melihat pengaruh minuman teh terhadap kadar glukosa darah selama 16 hari. Tahap 1 Teh daun murbei dan campuran teh hijau+teh daun murbei (rasio 1:1) dianalisa kandungan kimianya yang meliputi kadar air, ekstrak air, kadar abu, abu tak larut asam, abu larut dalam air, alkalinitas, kadar serat, teaflavin, tannin, dan
20 cafein. Analisis tersebut dilakukan di Laboratorium PPTK Bandung. Pada tahap ini untuk mendapatkan bahan baku minuman yang terbaik. Tahap 2 Penentuan kurva turnover glukosa darah tikus normal. Setelah melewati masa adaptasi, sebanyak 5 ekor tikus normal dipuasakan selama 24 jam (Wapnir & Lifshitz 1977). Setelah itu diberi ransum ad libitum. Tikus dipuasakan bertujuan untuk menurunkan kadar glukosa darah sampai pada kadar terendah, sehingga ketika diberi ransum akan terlihat pola peningkatan kadar glukosa darahnya. Pengukuran kadar glukosa darah dilakukan pada 0 menit (baseline) 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, dan 150 menit setelah mengkonsumsi ransum. Tahap ini untuk menentukan waktu maksimal terjadinya penyerapan makanan, dengan indikator terjadinya peningkatan glukosa darah. Tahap 3 Dua puluh ekor tikus diabetes mellitus dan lima ekor tikus normal digunakan dalam penelitian tahap ini. Tikus diabetes mellitus dibagi dalam 4 kelompok masing-masing 5 ekor tikus. Selanjutnya tikus dipuasakan selama 4 jam. Setelah dipuasakan, kelompok pertama sebanyak 5 ekor diberi air minum dalam kemasan (K) sebagai kontrol; kelompok kedua sebanyak 5 ekor diberi teh hijau (T); kelompok ketiga sebanyak 5 ekor diberi teh daun murbei (M), kelompok keempat sebanyak 5 ekor diberi campuran teh hijau+teh daun murbei (TM), dan 5 ekor tikus yang normal diberi air minum dalam kemasan (KN) sebagai kontrol normal. Dosis yang diberikan: 1 ml/100g BB atau setara dengan polifenol 100 mg/kg BB untuk setiap minuman yang diberikan dengan cara dicekok. Masingmasing disertai pemberian ransum ad libitum. Setiap ekor tikus dilakukan pemeriksaan kadar glukosa darah. Waktu untuk pemeriksaan kadar glukosa darah tikus dilakukan berdasarkan hasil penelitian tahap kedua. Tahap ini untuk melihat pengaruh minuman terhadap penghambatan glukosa darah. Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) faktorial, yang terdiri atas dua perlakuan, masing-masing empat taraf dan lima taraf. Jika perlakuan menunjukan berbeda nyata, maka untuk mengetahui perbedaan rerataan diantara perlakuan dilakukan dengan uji lanjut Beda Nyata Jujur (BNJ) atau disebut juga uji lanjut Tukey. Perlakuan yang diberikan adalah : A. Pemberian cekok (air minum dalam kemasan (kontrol), teh hijau, teh daun murbei, dan campuran teh hijau+teh daun murbei). B. Waktu (baseline, menit ke-30, menit ke-60, menit ke-90, dan menit ke-
21 120) n = 5 kali ulangan. model linear yang digunakan adalah : = µ+α i +β j +(αβ ij )+ε ijk Keterangan: = nilai pengamatan pada pemberian cekok ke-i, waktu ke-j dan ulangan ke-k. µ = nilai rata-rata. α i = pengaruh pemberian cekok ke-i. β j = pengaruh waktu ke-j. αβ ij = pengaruh reaksi pemberian cekok ke-i dan reaksi waktu ke-j. ε ijk = galat error dari cekok ke-i, waktu ke-j dan ulangan ke-k. Tahap 4 Setelah dilakukan penelitian tahap 3, masing-masing kelompok tikus tetap diberi ransum sampai 16 hari. Pencekokan minuman dilakukan setiap hari. Pengukuran glukosa darah dilakukan setiap empat hari yaitu: pada hari ke 0, 4, 8, 12, dan 16. Pengukuran glukosa darah dilakukan sebelum pemberian cekok hari berikutnya. Setiap hari dilakukan penimbangan terhadap ransum dan dua kali sehari dilakukan penimbangan berat badan tikus. Tahap ini untuk melihat pengaruh minuman terhadap penurunan kadar glukosa darah Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL) faktorial, yang terdiri atas dua perlakuan, masing-masing empat taraf dan lima taraf. Jika perlakuan menunjukan berbeda nyata, maka untuk mengetahui perbedaan rerataan diantara perlakuan dilakukan dengan uji lanjut Beda Nyata Jujur (BNJ) atau disebut juga uji lanjut Tukey. Perlakuan yang diberikan adalah : A. Pemberian cekok (air minum dalam kemasan (kontrol), teh hijau, teh daun murbei, dan campuran teh hijau+teh daun murbei). B. Waktu (baseline, hari ke-4, hari ke-8, hari ke-12, dan hari ke-16) n = 5 kali ulangan. model linear yang digunakan adalah = µ+α i +β j +(αβ ij )+ε ijk Keterangan: = nilai pengamatan pada pemberian cekok ke-i, waktu ke-j dan ulangan ke-k. µ = nilai rata-rata.
22 α i = pengaruh pemberian cekok ke-i. β j = pengaruh waktu ke-j. αβ ij = pengaruh reaksi pemberian cekok ke-i dan reaksi waktu ke-j. ε ijk = galat error dari cekok ke-i, waktu ke-j dan ulangan ke-k. Metode Analisa Kadar Glukosa Darah (Mahmudatussaadah 2005, yang dikutif dari Innan 1996) Pengukuran glukosa darah dengan glukometer menggunakan metode elektrokimia, yaitu berdasarkan pada pengukuran potensial (daya listrik) yang disebabkan oleh reaksi dari glukosa dengan bahan pereaksi glukosa pada elektroda strip. Strip uji mengandung bahan kimia: glukose oksidase 29.1 % b/b, heksasianoferat (III) 32.0% b/b dan bahan-bahan tidak reaktif 38.9% b/b. Prinsip kerjanya : sampel darah diserap masuk ke dalam ujung strip uji berdasarkan reaksi kapiler. Apabila darah mengisi ruangan reaksi pada strip uji, kalium ferisianida diuraikan dan glukosa sampel dioksidasi oleh enzim g!ukosa oxidase, menyebabkan penurunan bilangan oksidasi (kalium heksasianoferat (III) menjadi kalium heksasianoferat (II)). Aplikasi jumlah voltase yang konstan dari meteran mengoksidasi kalium heksasianoferat (II) kembali pada kalium heksasianoferat (III), dan memberikan elektron. Elektron yang dihasilkan untuk menimbulkan arus sebanding dengan kadar glukosa pada sampel. Setelah waktu 60 detik, konsentrasi glukosa dalam sampel ditayangkan pada layar monitor. Cara mengukur glukosa darah tikus percobaan: ekor tikus uji dihangati dengan air hangat, selanjutnya ditusuk dengan jarum dan darah yang menetes dikenakan pada strip glukometer. Kadar glukosa darah dinyatakan dalam mg/dl. Analisis Data Data hasil analisis karakteristik kimia daun murbei dan kombinasi teh daun murbei+teh hijau, yang bertujuan untuk mendapatkan produk teh yang terbaik diuji dengan uji t (t-tes). Hasil uji pengaruh teh hijau, teh daun murbei, dan kombinasi teh hijau+teh daun murbei terhadap kadar glukosa darah tikus diabetes melitus diuji dengan uji Analisis of Varians (ANOVA). Data diolah dan dianalisis menggunakan Microsoft Excel dan SPSS 12.0.