BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan rancangan the post test only controlled group design (Taufiqurahman, 2004). B. Lokasi Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Parasitologi dan Mikologi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. C. Subyek Penelitian Sampel penelitian ini berupa cacing Ascaris suum Goeze sebagai pengganti Ascaris lumbricoides. Hal ini karena Ascaris lumbricoides sukar ditemukan karena jarang keluar secara spontan dari tubuh penderita askariasis. Ascaris suum Goeze adalah cacing gelang yang terdapat dalam usus halus babi. Cacing ini mempunyai siklus hidup dan cara infeksi yang sama dengan Ascaris lumbricoides (Roberts dan Janovy, 2005). Lokasi pengambilan sampel dilakukan di tempat penyembelihan Radjakaya Surakarta dengan kriteria sampel sebagai berikut: 1. Kriteria Inklusi Cacing yang masih hidup dan aktif bergerak, dengan ukuran cacing 15-35 cm tanpa membedakan jenis kelamin cacing. 24
25 2. Kriteria Eksklusi Cacing yang mati atau tidak aktif bergerak dan memiliki cacat anatomis. D. Besar Sampel Besar/jumlah sampel di tiap cawan petri dihitung menggunakan rumus Federer (Sudigdo dan Ismail, 2008) : (n-1) (t-1) 15 Keterangan : n : jumlah sampel t : jumlah kelompok perlakuan Penelitian ini menggunakan 7 kelompok perlakuan, maka : (n-1) (t-1) 15 (n-1) (7-1) 15 6n 21 n 3,5 Dari hasil perhitungan dengan rumus Federer, tiap kelompok penelitian berisi 4 ekor cacing.
26 Sedangkan untuk menentukan besar jumlah ulangan (replikasi) juga dihitung menggunakan rumus Federer sebagai berikut: (n-1) (t-1) 15 Keterangan : n : jumlah ulangan (replikasi) t : jumlah kelompok perlakuan Penelitian ini menggunakan 7 kelompok perlakuan, maka : (n-1) (t-1) 15 (n-1) (7-1) 15 6n 21 n 3,5 Dari hasil perhitungan dengan rumus Federer, tiap kelompok penelitian akan direplikasi sebanyak 4 kali. Jumlah cacing yang digunakan dalam penelitian akhir adalah 4 cacing x 7 kelompok x 4 ulangan = 112 ekor. E. Teknik Sampling Penelitian ini menggunakan teknik sampling purposive sampling. Purposive sampling adalah suatu teknik penetapan sampel dengan cara memilih sampel di antara populasi sesuai dengan yang dikehendaki peneliti
27 (tujuan/masalah dalam penelitian), sehingga sampel tersebut dapat mewakli karakteristik populasi yang telah dikenal sebelumnya (Taufiqurahman, 2004). F. Identifikasi Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas (Independent Variable) Konsentrasi ekstrak etanol daun katuk (Sauropus androgynus (L.) Merr.) 2. Variabel Terikat (Dependent Variable) Waktu kematian cacing setelah perlakuan 3. Variabel Perancu (Confounding Variable) a. Variabel Perancu yang Terkendali 1) Jenis cacing 2) Ukuran cacing 3) Suhu percobaan b. Variabel Perancu yang Tidak Terkendali 1) Umur cacing. 2) Variasi kepekaan cacing terhadap larutan uji G. Definisi Operasional Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas: Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Katuk (Sauropus androgynus (L.) Merr.) Daun Katuk (Sauropus androgynus (L.) Merr.) diambil dari perkebunan yang terdapat di daerah Sukabumi, Jawa Barat. Daun dipetik pada waktu tanaman tersebut sedang berbunga (Wijono, 2003).
28 Ekstrak daun katuk adalah serbuk daun katuk yang diekstraksi menggunakan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70 % yang hasil akhirnya berbentuk ekstrak kental dan konsentrasinya dianggap 100 %. Ekstraksi daun katuk dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gajah Mada Yogyakarta. Konsentrasi ekstrak daun katuk adalah konsentrasi yang dibuat dengan cara melarutkan ekstrak daun katuk yang didapatkan melalui metode maserasi ke dalam larutan NaCl 0,9 % hingga tercapai konsentrasi yang diinginkan. Uji penelitian ini menggunakan konsentrasi ekstrak etanol daun katuk (Sauropus androgynus (L.) Merr.) sebesar 40%; 42,5%; 45%; 47,5%; dan 50% yang ditentukan melalui penelitian pendahuluan terlebih dahulu. Skala pengukuran variabel ini adalah skala interval. 2. Variabel Terikat: Waktu Kematian Cacing Waktu kematian cacing adalah waktu matinya semua cacing dalam tiap rendaman setelah pemberian perlakuan dalam satuan menit. Pengamatan dilakukan hingga semua cacing mati selama waktu maksimal pengamatan. Waktu maksimal pengamatan diketahui melalui pengamatan pada kontrol negatif pada penelitian pendahuluan. Cacing yang dianggap mati adalah cacing yang tidak bergerak atau tidak berespon ketika disentuh dengan pinset anatomis. Skala pengukuran variabel ini adalah skala rasio.
29 3. Variabel Perancu a. Variabel Perancu Terkendali 1) Jenis cacing Cacing yang digunakan adalah cacing gelang babi (Ascaris suum Goeze) yang hidup di usus babi. Cacing yang telah diambil kemudian dimasukkan ke dalam larutan NaCl 0,9% dan dibawa ke Laboratorium Parasitologi dan Mikologi. 2) Ukuran cacing Ukuran cacing adalah panjang rata-rata untuk cacing gelang babi dewasa, diukur dalam satuan sentimeter (cm). Cacing yang digunakan dalam penelitian ini berukuran 15-35 cm, tanpa membedakan jenis kelamin cacing. 3) Suhu Percobaan Suhu percobaan dikendalikan dengan inkubator pada suhu 37 C karena menyerupai dengan kondisi lingkungan dalam tubuh inang. b. Variabel Perancu Tidak Terkendali 1) Umur cacing Peneliti tidak dapat mengetahui sejak kapan cacing hidup di usus babi, serta tidak mengetahui waktu pasti telur menetas menjadi dewasa. Sehingga umur cacing merupakan variabel yang tidak dapat dikendalikan.
30 2) Variasi Kepekaan cacing dalam larutan uji Variasi kepekaan masing-masing cacing dalam larutan uji dipengaruhi oleh banyak faktor sehingga merupakan variabel perancu yang tidak terkendali.
31 H. Rancangan Penelitian 1. Penelitian pendahuluan Ascaris suum Goeze Direndam dalam larutan NaCl 0,9% Direndam dalam larutan ekstrak dengan konsentrasi 30%, 40%, dan 50% Direndam dalam larutan pirantel pamoate 5 mg/ml Inkubasi pada suhu 37 C selama 15 menit Pengamatan tepat setelah perlakuan hingga cacing mati Dicatat lama waktu kematian tiap cacing Hasil digunakan sebagai acuan waktu maksimal pengamatan pada penelitian akhir Hasil digunakan sebagai acuan pemilihan konsentrasi pada penelitian akhir Hasil yang diperoleh digunakan sebagai kontrol positif Gambar 3.1 Skema Penelitian Pendahuluan
32 2. Uji Penelitian Ascaris suum Goeze Direndam dalam larutan NaCl 0,9% Direndam dalam larutan ekstrak dengan konsentrasi 40%; 42,5%; 45%; 47,5%; dan 50% Direndam dalam larutan pirantel pamoate 5 mg/ml Inkubasi pada suhu 37 C selama 15 menit Pengamatan tepat setelah perlakuan hingga cacing mati Dicatat lama waktu kematian tiap cacing Direplikasi 4 kali Uji Kruskal-Wallis Uji Mann-Whitney Gambar 3.2 Skema Uji Penelitian
33 I. Alat dan Bahan Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah stoples dengan diameter 15 cm, pengaduk kaca, labu takar, gelas ukur, pinset anatomis, inkubator, sarung tangan, timbangan elektrik, stoples, stopwatch, penggaris, alat tulis, pemanas, dan kamera digital. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah cacing Ascaris suum Goeze, larutan NaCl 0,9%, ekstrak daun katuk dan pirantel pamoate 250 mg. J. Cara Kerja Penelitian 1. Tahap Persiapan a. Pengambilan Bahan Daun katuk yang akan diekstrak didapatkan dari perkebunan di Sukabumi, Jawa Barat. Daun katuk dicuci bersih pada air mengalir, untuk menghilangkan kotoran yang melekat. Kemudian, daun dikeringkan dalam almari pengering pada suhu 40 C sampai kering untuk mencegah pembusukan oleh bakteri. Daun katuk kering selanjutnya dihaluskan menjadi serbuk, diayak dan ditimbang (Christi, 2014). b. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Katuk (Sauropus androgynus (L.) Merr.) Pembuatan ekstrak dilakukan oleh tenaga ahli Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada (LPPT
34 UGM) Yogyakarta. Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi dengan pelarut etanol 70%. Prosedur maserasi antara lain sebagai berikut: 1) Serbuk kering daun katuk sebanyak 2000 g ditambahkan pelarut etanol 70% dengan volume 5 liter, kemudian diaduk selama 30 menit dan didiamkan 24 jam. Campuran kemudian disaring. 2) Proses pencampuran dan penyaringan diulang sebanyak dua kali. Dari penyaringan terakhir didapatkan filtrat dan residu (ampas). 3) Filtrat kemudian diuapkan dengan vacuum rotary evaporator pada suhu 70 C. Dari penguapan didapatkan ekstrak kental. 4) Ekstrak kental daun katuk dituang dalam cawan porselen dan dipanaskan dengan waterbath suhu 70 C sambil terus diaduk. c. Penentuan Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun Katuk (Sauropus androgynus (L.) Merr.) Konsentrasi larutan ekstrak etanol daun katuk (Sauropus androgynus (L.) Merr.) yang digunakan dalam uji penelitian adalah sebagai berikut: Konsentrasi I (40%) : 40 g ekstrak ditambahkan NaCl 0,9% sampai didapatkan volume 100 ml Konsentrasi II (42,5%) : 42,5 g ekstrak ditambahkan NaCl 0,9% sampai didapatkan volume 100 ml Konsentrasi III (45%) : 45 g ekstrak ditambahkan NaCl 0,9% sampai didapatkan volume 100 ml
35 Konsentrasi IV (47,5%) : 47,5 g ekstrak ditambahkan NaCl 0,9% sampai didapatkan volume 100 ml Konsentrasi V (50%) : 50 g ekstrak ditambahkan NaCl 0,9% sampai didapatkan volume 100 ml d. Pembuatan Larutan Pirantel Pamoat Penelitian ini menggunakan kontrol positif pirantel pamoat dengan nama dagang Combantrin yang diproduksi oleh PT. Pfizer Indonesia. Bentuk sediaan obat berupa Combantrin tablet 250 mg. Cara membuat larutan pirantel pamoat 5 mg/ml adalah dengan melarutkan 1 tablet Combantrin 250 mg dalam 50 ml aquades. 2. Tahap Penelitian a. Penelitian Pendahuluan 1) 5 buah stoples yang telah disiapkan, masing-masing diisi 50 ml larutan uji yang terlebih dahulu dihangatkan dalam inkubator pada suhu 37 C selama 15 menit. Larutan uji terdiri dari larutan NaCl 0,9% (kontrol negatif), larutan pirantel pamoat 5 mg/ml (kontrol positif), larutan ekstrak etanol daun katuk (Sauropus androgynus (L.) Merr.) dengan konsentrasi 30%, 40%, dan 50%. 2) Cacing Ascaris suum Goeze sebanyak 4 ekor dimasukkan pada masing-masing stoples. 3) Cacing di dalam stoples diinkubasi pada suhu 37 C.
36 4) Pengamatan dilakukan tepat setelah perlakuan hingga semua cacing mati. Cacing tersebut disentuh dengan pinset anatomis dan dinyatakan mati apabila sudah tidak bergerak. 5) Penelitian dilakukan dengan 2 kali replikasi. 6) Hasil yang dicatat berupa waktu kematian setiap cacing. 7) Pengamatan dihentikan setelah seluruh cacing dalam kelompok perlakuan mengalami kematian. b. Uji Penelitian 1) 7 buah stoples disiapkan, masing-masing berisi 50 ml larutan uji yang terlebih dahulu dihangatkan dalam inkubator pada suhu 37 C selama 15 menit. Larutan uji terdiri dari larutan NaCl 0,9% (kontrol negatif), larutan pirantel pamoat 5 mg/ml (kontrol positif), larutan ekstrak etanol daun katuk (Sauropus androgynus (L.) Merr.) dengan konsentrasi 40%; 42,5%;45%; 47,5%; dan 50%. 2) Cacing Ascaris suum Goeze sebanyak 4 ekor dimasukkan pada masing-masing stoples. 3) Cacing di dalam stoples diinkubasi pada suhu 37 C. 4) Pengamatan dilakukan tepat setelah perlakuan hingga semua cacing mati. Cacing tersebut disentuh dengan pinset anatomis dan dinyatakan mati apabila sudah tidak bergerak. 5) Penelitian dilakukan dengan 4 kali replikasi. 6) Hasil yang dicatat berupa waktu kematian setiap cacing.
37 7) Pengamatan dilakukan hingga waktu maksimal pengamatan berdasarkan hasil penelitian pendahuluan. K. Teknik Analisis Data Data yang diperoleh berupa waktu kematian setiap cacing dan dianalisis dengan menggunakan program Statistical Product and Service Solution (SPSS) versi 22. Analisis yang telah dilakukan penelitian ini diuraikan sebagai berikut: 1. Uji Normalitas Shapiro-Wilk Uji normalitas dilakukan untuk mengetahui normalitas sebaran data, sehingga dapat dilakukan statistik parametrik. Terdapat dua metode untuk menguji normalitas data yaitu metode deskriptif (menghitung koefisien varians, rasio kurtosis, histogram dan plot) dan metode analitik (uji Kolmogorov-Smirnov atau Shapiro-Wilk). Uji Kolmogorov-Smirnov digunakan untuk sampel lebih dari 50, dan uji Shapiro-Wilk untuk sampel kurang dari 50. Metode analitik yang dipakai dalam analisis penelitian ini adalah Shapiro-Wilk karena jumlah sampel yang diuji pada setiap kelompok perlakuan kurang dari 50 (Dahlan, 2011). 2. Uji Homogenitas Variansi (Levene Test) Uji homogenitas variansi dilakukan untuk mengetahui apakah seluruh sampel memiliki varian yang homogen. Hal ini merupakan syarat ke dua untuk melakukan analisis parametrik.
38 3. Uji Kruskal-Wallis Uji Kruskal-Wallis merupakan uji alternatif yang digunakan apabila uji One Way ANOVA tidak dapat dilakukan karena syarat uji parametrik tidak terpenuhi. Uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah rerata waktu kematian setiap kelompok perlakuan memiliki perbedaan yang signifikan atau tidak (Dahlan, 2011). 4. Uji Mann-Whitney Uji Mann-Whitney dilakukan untuk mengetahui kelompok perlakuan mana yang mempunyai perbedaan rerata waktu kematian cacing dengan kelompok lainnya. Uji Mann-Whitney merupakan alat untuk melakukan analisis Post Hoc untuk uji Kruskal-Wallis (Dahlan, 2011).