20 MATERI DAN METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Proses penelitian berlangsung mulai dari bulan April 2009 sampai Agustus 2010. Operasi implantasi dilakukan di Laboratorium Bagian Bedah dan Radiologi, Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi (KRP), Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Pemeliharaan dan perawatan hewan coba dilakukan di Kandang Hewan Percobaan yang dikelola Unit Pelayanan Teknis Hewan Laboratorium (UPT Helab) FKH-IPB. Pembuatan preparat histologi dilakukan di Laboratorium Patologi, Departemen KRP serta di Laboratorium Anatomi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi (AFF), FKH-IPB. Materi Penelitian Hewan coba yang digunakan pada penelitian ini adalah 3 ekor domba lokal (2 ekor jantan dan 1 ekor betina) yang sehat, berumur sekitar 1,5-2 tahun dengan kisaran berat badan 19-20 kg. Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain: termometer, stetoskop, pulse oxymetri, alat cukur, peralatan bedah minor, peralatan bedah orthopedik, perlengkapan operator dan asisten bedah, serta kamera digital. Sedangkan untuk pembuatan dan pengamatan preparat histologi antara lain: gergaji triplek, inkubator, tissue cassette, automatic tissue processor, shaker, mikrotom, pencetak parafin, gelas objek, gelas penutup, mikroskop OLYMPUS BX51, dan alat mikrofotografi MD 130 electric eyepiece. Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain: implan komposit hidroksiapatit-kitosan (HA-K), atropin sulfas 0,25 mg/ml, xylazine HCl 2%, isofluran 1,5-3%, penicillin 50.000 IU, cefotaxime 250 mg, analgesik Toradol, yodium tinktur, perubalsam, Levertraan Zalf, dan Gusanex. Sedangkan untuk pembuatan preparat histologi antara lain: formalin 10%, asam nitrat 5%, akuades, akuabides, alkohol, silol, pewarna Hematoksilin-Eosin (HE), pewarna Hematoksilin dan Permount.
21 Metode Penelitian 1. Persiapan Implan Komposit Hidroksiapatit-Kitosan (HA-K) Implan komposit HA-K telah dibuat sebelumnya oleh Ai Nurlaela, mahasiswa Sekolah Pascasarjana IPB (Nurlaela 2009). Implan tersebut dihasilkan dari metode presipitasi kalsium dan fosfat dengan rasio perbandingan 0,5M:0,3M. Sumber kalsium didapatkan dari ekstraksi cangkang telur ayam dan sumber fosfat dari KH 2 PO 4. Sedangkan kitosannya merupakan produk dari Departemen Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB. Sintesis HA-K dilakukan dengan dua tahap. Tahap pertama pembentukan hidroksiapatit dan tahap kedua penggabungan hidroksiapatit dengan kitosan. Serbuk komposit yang dihasilkan dari proses tersebut selanjutnya dikemas dalam bentuk tabung silinder (pellet). 2. Pemeliharaan Hewan Coba Domba dipelihara dalam lingkungan kandang yang memadai dengan sirkulasi udara yang cukup, pencahayaan dan temperatur normal, asupan pakan sebanyak dua kali sehari disertai asupan air ad libitum. Pemeliharaan domba dilakukan selama 10 hari sebelum operasi implantasi untuk evaluasi kondisi hewan, serta selama 30, 60, dan 90 hari setelah operasi untuk pengamatan dan pengambilan data penelitian. 3. Operasi Implantasi (Pemasangan Implan) Operasi implantasi dilakukan sesuai dengan prosedur bedah aseptis. Sebelum dilakukan pembiusan, semua domba diberikan pre-anestesi atropin sulfas dengan dosis 0,2 mg/kg (SC) (Plumb 2005). Pembiusan dilakukan dengan xylazine HCl dengan dosis 0,2 mg/kg (IM) dan 0,10 mg/kg (IV) (Plumb 2005) serta isofluran secara inhalasi. Penanaman implan dilakukan pada bagian medial dari ujung proksimal tulang tibia kaki kiri. Tulang tersebut dilubangi dengan bor tulang sesuai dengan ukuran implan yang berdiameter ± 6,6 mm dan tinggi ± 5,3 mm. Sedangkan untuk kontrolnya, bagian yang sama dari tulang tibia kaki kanan dibuat lubang serupa namun dibiarkan kosong tanpa implan. Luka sayatan operasi kemudian ditutup dengan penjahitan periosteum, otot, subkutan, dan kulit dengan jahitan sederhana (Fossum et al. 2007). Semua
22 domba diberi antibiotik topikal dan per-injeksi sebanyak dua kali sehari serta diberikan analgesik satu kali sehari selama lima hari pascaoperasi. Luka operasi secara rutin dibersihkan dengan yodium tinktur dan dioleskan campuran perubalsam dan Levertraan Zalf. Gusanex juga diberikan sebagai anti miasis. 4. Studi Histologi Seluruh tulang tibia kemudian diambil pada hari ke-30, 60, dan 90 pascaoperasi. Untuk data makroskopis, bagian tulang yang terdapat implan dipotong melintang menjadi dua bagian menggunakan gergaji triplek dengan mata gergaji berukuran kecil. Penentuan lokasi pemotongan ditentukan dengan melihat gambaran radiografi tulang. Potongan melintang tersebut kemudian diobservasi dan difoto dengan kamera digital. Kajian makroskopis dilakukan dengan pengamatan langsung mencakup aspek keadaan, warna, bentuk, dan tingkat degradasi implan serta pertumbuhan jaringan baru ke dalam implan. Sedangkan untuk data mikroskopis, tulang yang telah terpotong dua tersebut kemudian direndam dalam cairan formalin 10% minimal selama sebulan. Bagian tulang yang terdapat implan selanjutnya dipotong melintang lagi menjadi beberapa potongan setebal ± 1-2 mm untuk pembuatan preparat gosok dan dekalsifikasi. 5. Pembuatan Preparat Gosok Sebagian potongan tulang tersebut kemudian ditipiskan dengan cara menggosoknya dengan amplas berukuran agak kasar (300) sampai terhalus (1500). Penggosokan dilakukan secara teratur dan perlahan agar tidak merusak struktur tulang. Setiap kali menggosok, dilakukan pencucian terhadap preparat dengan akuades steril untuk menghilangkan kotoran dan debu sisa gosokan. Setelah mendapatkan ketipisan yang sesuai, preparat gosok tersebut kemudian dicuci dengan akuabides steril selama ± 2 malam, menggunakan alat EYELA Multi Shaker MMS dengan kecepatan pada skala 5-6. Akuabides diganti setiap hari agar kotorannya terbuang. Setelah bersih, preparat kemudian diletakkan dalam inkubator selama semalam agar kering. Selanjutnya dilakukan proses pewarnaan dan dehidrasi. Pewarnaan dilakukan dengan pewarna Hematoksilin selama beberapa menit dan dibilas dengan akuades. Setelah didapatkan warna dan kontras yang sesuai, preparat kemudian didehidrasi dengan larutan alkohol bertingkat (mulai
23 dari konsentrasi 70%, 80%, 80%, 90%, 96%, absolut 1, hingga absolut 2), kemudian direndam dalam larutan silol bertingkat (mulai dari silol 1, silol 2, hingga silol 3). Preparat lalu dilekatkan dengan gelas penutup menggunakan Permount dan diberi label. Pengamatan preparat selanjutnya dilakukan dengan mikroskop cahaya. 6. Pembuatan Preparat Dekalsifikasi Sebagian potongan tulang lainnya kemudian direndam dalam larutan dekalsifikasi (asam nitrat 5%) sampai lunak selama ± 2 minggu. Tulang terus dipantau sampai benar-benar terdekalsifikasi. Ciri-ciri tulang terdekalsifikasi ialah strukturnya menjadi lebih fleksibel, transparan, dan mudah ditusuk atau digores (Nandi et al. 2009). Setelah itu, tulang dicuci dengan air mengalir selama 24 jam, kemudian dinetralkan dengan larutan formalin 10% untuk menghilangkan mineral seperti kalsium dan magnesium yang masih tersisa. Selanjutnya dicuci kembali dengan air mengalir selama 1-2 hari. Tulang tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tissue cassette untuk proses dehidrasi. Dehidrasi dilakukan dengan larutan alkohol bertingkat masing-masing selama 2 jam, kemudian direndam dalam larutan silol bertingkat masing-masing selama 40 menit. Proses dehidrasi tersebut menggunakan alat Automatic Tissue Processor Sakura. Selanjutnya tulang diletakkan dalam parafin cair (embedding) bersuhu ± 60 o C selama 2 jam dan dimasukkan ke dalam blok pencetak. Kemudian blok organ disimpan sejenak di dalam lemari pendingin dan dipotong dengan mikrotom hingga mencapai ketebalan 5-6 µm. Sayatan tersebut lalu diletakkan di atas permukaan air hangat (38-40 o C), kemudian ditempel pada gelas objek dan dikeringkan di inkubator bersuhu 60 o C selama semalam. Terakhir slide preparat tersebut diwarnai dengan pewarnaan HE (Hematoksilin-Eosin). Tahapan pewarnaan HE yaitu: deparafinisasi dengan perendaman dalam silol bertingkat dan alkohol bertingkat masing-masing selama 2 menit. Kemudian preparat dibilas dengan air dan diwarnai dengan pewarna Hematoksilin selama 2-3 menit. Preparat dibilas kembali dengan air dan direndam dalam litium karbonat selama 10 detik. Preparat kemudian dibilas kembali dengan air dan diwarnai dengan pewarna Eosin selama 6-7 menit. Preparat lalu dibilas dengan air kembali dan selanjutnya didehidrasi kembali dengan akohol bertingkat dan silol bertingkat.
24 Preparat lalu dilekatkan dengan gelas penutup menggunakan Permount diberi label. Pengamatan preparat dilakukan dengan mikroskop cahaya. dan 7. Evaluasi Histologi Preparat tulang gosok dan dekalsifikasi tersebut kemudian diobservasi untuk melihat perubahan gambaran histologi yang terjadi setiap waktu pengambilan sampel. Untuk preparat gosok, pengamatan ditekankan terhadap pola pertumbuhan tulang baru yang terbentuk selama proses persembuhan. Sedangkan untuk preparat dekalsifikasi, aspek-aspek berikut dapat diobservasi secara histologi mengacu pada Sunil et al. (2008) antara lain: (i) pertumbuhan dan regenerasi tulang, (ii) ikatan antara implan dengan tulang, (iii) pertumbuhan tulang baru ke dalam implan, (iv) tanda-tanda keberadaan implan pada akhir pengamatan, dan (v) tanda-tanda reaksi inflamasi di sekitar implan. Hasil pengamatan kemudian dituliskan ke dalam format tabel seperti yang tertulis pada Tabel 2. Analisis data dilakukan secara deskriptif terhadap gambaran histologi preparat. Kemudian dilakukan dokumentasi gambaran histologi tersebut dengan mikroskop cahaya yang dilengkapi kamera mikrofotografi. Rangkaian prosedur penelitian secara singkat disajikan dalam sebuah diagram alir (Gambar 8). Tabel 2 Format data hasil pengamatan evaluasi histologi terhadap preparat dekalsifikasi Karakteristik Histologi yang Diamati 1. Proliferasi jaringan ikat ke dalam implan. 2. Pertumbuhan tulang baru pada perifer implan. 3. Pertumbuhan tulang baru di tengah implan. 4. Proliferasi sumsum tulang. 5. Ikatan antara tulang lama dengan implan. 6. Pembentukan trabekula di dalam implan. 7. Biodegradasi. 8. Reaksi inflamasi pada sekitar implan. Periode Pengamatan 30 hari 60 hari 90 hari
25 Pemasangan implan pada 3 ekor domba lokal berumur 1,5-2 tahun dengan berat badan 19-20 kg. Bagian medial dari ujung proksimal tulang tibia kiri sebagai perlakuan. Bagian medial dari ujung proksimal tulang tibia kanan sebagai kontrol. Pengambilan tulang tibia dilakukan pada hari ke-30 untuk domba pertama, ke-60 untuk domba kedua, dan ke-90 untuk domba ketiga. Pengamatan dan pengambilan data makroskopis. Mencakup keadaan, warna, bentuk dan tingkat degradasi implan serta pertumbuhan jaringan baru ke dalam implan. Pembuatan preparat histologi: preparat gosok dan dekalsifikasi. Pewarnaan preparat gosok dengan Hematoksilin. Pewarnaan preparat dekalsifikasi dengan HE. Pengamatan dan pengambilan data mikroskopis. Mencakup aspek pertumbuhan dan regenerasi tulang, ikatan antara implan dengan tulang, pertumbuhan tulang baru ke dalam implan, keutuhan implan, dan tandatanda reaksi inflamasi di sekitar implan. Gambar 8 Diagram prosedur penelitian.