BAB III METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini telah dilakukan pada bulan Oktober sampai dengan November 2015. Pengambilan sampel Phaeoceros laevis (L.) Prosk. dilakukan di daerah Karangpandan dan Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah pada ketinggian ±1.100-1.400 m dpl (Gambar 6). Proses ekstraksi dan skrining fitokimia dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis dilakukan di Laboratorium Biologi dan Sub Laboratorium Biologi Pusat FMIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta. Gambar 6. Lokasi Pengambilan Sampel Phaeoceros laevis (L.) Prosk. 24
25 B. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam menentukan lokasi dan teknik pengambilan sampel P. laevis antara lain Global Positioning System (GPS), handlens, pinset, kantong plastik, pisau, label, kertas koran, pensil dan bolpoint. Untuk penyiapan sampel ekstraksi P. laevis menggunakan kain hitam, wadah, pinset, saringan, dan timbangan analitik. Alat yang digunakan dalam ektraksi senyawa metabolit sekunder P. laevis berupa seperangkat alat maserasi, yaitu: blender, gelas ukur, pengaduk, corong, erlenmeyer, gelas beker, spatula, alumunium foil, kertas saring, cawan porselen, timbangan analitik, gelas maserasi dan rotary evaporator. Alat untuk analisis profil senyawa metabolit sekunder menggunakan plat silika gel GF 254, bejana pengembang (chamber), alat penyemprot bercak, mikropipet, oven, pipa kapiler dan UV 254 nm. 2. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah lumut tanduk (Phaeoceros laevis (L.) Prosk.) yang dikoleksi dari daerah Karangpandan dan Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah, pada ketinggian ±1.100-1.400 m dpl. Pembuatan ekstrak P. laevis dengan metode maserasi menggunakan pelarut metanol dan kloroform. Bahan untuk menganalisis golongan senyawa metabolit sekunder adalah kloroform : n-heksana (9:1 v/v), n-heksana : etil asetat (4:1 v/v) dan kloroform : metanol (9:1 v/v), pereaksi semprot umum
26 (serium (IV) sulfat) reagen ferri (III) klorida (FeCl 3 ), reagen Dragendorff, dan reagen Lieberman Burchard. C. Cara Kerja 1. Pengambilan Sampel P. laevis Pengambilan P. laevis dilakukan dengan cara menjelajah área di Karangpandan dan Tawangmangu yang umumnya ditumbuhi tumbuhan tersebut. P. laevis diambil sebanyak ± 1 kg. Apabila ditemukan menempel cukup kuat pada substrat, maka diambil dengan cara disayat menggunakan pisau dan mengikutsertakan sedikit substratnya. Handlens digunakan untuk pengamatan dan memastikan bahwa P. laevis tidak tercampur dengan jenis lumut lainnya. Apabila ditemukan lumut campuran, lumut yang satu dengan lainnya dipisahkan dengan menggunakan pinset berujung runcing. Setelah itu, dimasukkan ke dalam kantong plastik atau kertas koran bekas (Windadri, 2004). 2. Penyiapan Sampel P. laevis P. laevis disortasi untuk dipisahkan dari kotoran-kotoran atau bahanbahan asing kemudian dicuci dengan air mengalir sampai bersih lalu ditiriskan. Sampel tersebut kemudian dikeringkan dalam wadah dengan diletakkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung dengan ditutupi kain hitam, kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender sampai menjadi serbuk lalu ditimbang beratnya (Ristiningsih, 2009). 3. Ekstraksi Senyawa Metabolit Sekunder
27 Serbuk P. laevis diekstraksi menggunakan dua pelarut yaitu kloroform dan metanol. Serbuk P. laevis sebanyak 66 g dimaserasi menggunakan pelarut kloroform dengan perandingan 1:5 yang dilakukan sebanyak dua kali pengulangan. Setiap pengulangan dilakukan selama 24 jam. Hal yang sama dilakukan pada pelarut metanol. Proses ekstraksi dilakukan dengan cara direndam dengan pelarut kemudian disaring menggunakan kertas saring. Selanjutnya pelarut diuapkan dengan rotary evaporator pada suhu 40 o C, kecepatan 40 rpm dan tekanan 0,06-0,08 Mpa sampai diperoleh ekstrak kental (Widyana et al., 2014). Ekstrak kental yang diperoleh, ditimbang dan dihitung rendemennya terhadap berat simplisia awal. Rumus % rendemen ekstrak menurut Khoirani (2013) adalah: % rendemen ekstrak = Bobot ekstrak yang didapat (g) 100 % Bobot simplisia yang diekstraksi (g) 4. Analisis Profil Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Metabolit Sekunder Setiap ekstrak yang diperoleh kemudian dianalisis profil senyawa kimianya menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis. Ekstrak kloroform dan metanol P. laevis dielusi menggunakan sistem fase diam dan fase gerak yang sama pada kondisi bejana yang sama pula. Hal ini dilakukan untuk mengetahui hasil yang ditandai oleh munculnya bercak yang berbeda pada KLT untuk masing-masing ekstrak (Wahyuningsih et al., 2008). Ekstrak kloroform dan metanol ditotolkan pada lempeng KLT dengan fase diam silika gel GF 254 dan dielusi dengan menggunakan fase gerak berupa kloroform - n- heksana (9:1 v/v), n-heksana : etil asetat (4:1 v/v) dan kloroform-metanol (9:1 v/v) dalam bejana pengembang. Batas pelarut berada di bawah garis pada
28 posisi bercak berada. Setelah eluen mencapai garis akhir elusi, plat dikeluarkan dan dikeringkan. Plat silika gel GF 254 dibuat dengan ukuran lebar 2 cm dan panjang 9 cm dan diberi batas awal 1 cm dan batas akhir 0,5 cm. Profil kandungan kimia ekstrak kloroform dan ekstrak metanol dideteksi menggunakan sinar UV 254 nm dan disemprot dengan pereaksi semprot tertentu untuk mendeteksi kandungan senyawa tertentu. Parameter yang diamati adalah golongan senyawa metabolit sekunder P. laevis dan nilai Rf (Retardation Factor). Pada kromatografi lapis tipis, derajat retensi dinyatakan sebagai Rf, yang dapat dirumuskan (Gritter et al., 1991): Rf = Jarak gerakan zat terlarut Jarak gerakan pelarut Jarak gerakan zat terlarut diukur sampai tengah-tengah bercak atau pada titik kerapatan maksimum sedangkan jarak gerakan pelarut diukur sampai bidang batas pelarut (Gritter et al., 1991). 5. Analisis Golongan Senyawa Metabolit Sekunder a. Serium (IV) Sulfat Merupakan pereaksi untuk deteksi senyawa organik yang umum. Cara pembuatannya adalah serium sulfat anhidrat 0,5 N dilarutkan dalam asam sulfat pekat 1,4 ml kemudian diencerkan dengan menambahkan aquades 25 ml. Cara mengaplikasikan metode ini terhadap KLT yaitu plat silika gel GF 254 disemprot dengan pereaksi serium (IV) sulfat.
29 Adanya senyawa organik dapat ditunjukkan dengan adanya bercak warna cokelat (Ristiningsih, 2009). b. Lieberman Burchard Lieberman Burchard merupakan pereaksi semprot untuk deteksi steroid dan terpenoid. Cara pembuatan pereaksi semprot Lieberman Burchad ini dilakukan dengan mencampur 5 ml asam asetat anhidrida secara hati-hati dengan 5 ml asam sulfat pekat, kemudian campuran ini ditambahkan juga secara hati-hati dengan 50 ml etanol absolut. Setiap pencampuran zat dilakukan dengan pendinginan (Ristiningsih, 2009). Cara mengaplikasikan metode ini terhadap KLT yaitu pada plat silika gel GF 254 disemprot dengan pereaksi Lieberman Burchard yang kemudian dipanaskan selama 10 menit pada suhu 100 o C. Adanya terpenoid ditandai dengan munculnya warna merah violet (Wagner, 1984; Cannel, 1998) sedangkan adanya steroid ditandai dengan munculnya warna cokelat kemerahan (Wagner dan Bladt, 1996). c. Dragendorff Dragendorff merupakan pereaksi semprot untuk senyawa alkaloid. Cara pembuatan pereaksi ini adalah dengan menambahkan 10 ml KI (Kalium Iodida) 40% ke dalam 10 ml campuran 0,85 g bismut subnitrat, asam asetat 10 ml dan aquades 50 ml (Ristiningsih, 2009). Tidak semua noda atau bercak yang menandakan adanya alkaloid bisa dilihat dengan UV 254 nm. Oleh karena itu, cara mengaplikasikan metode ini terhadap KLT yaitu plat silika gel GF 254 disemprot dengan
30 pereaksi Dragendorff untuk menampakkan noda atau bercaknya. Adanya alkaloid ditandai dengan munculnya bercak berwarna jingga/orange sampai merah yang dapat dilihat secara langsung (Ristiningsih, 2009). d. FeCl 3 Merupakan deteksi senyawa semprot untuk fenol. Pembuatan senyawa ini adalah dengan cara menambahkan 5% alumunium klorida ke dalam 0,5 N HCl. Cara mengaplikasikan metode ini terhadap KLT yaitu plat silika gel GF 254 disemprot dengan pereaksi FeCl 3 kemudian dipanaskan pada suhu 100-105 o C (Ristiningsih, 2009). Adanya senyawa fenol dapat ditunjukkan dengan adanya bercak warna biru kehitaman, hijau atau biru kehijauan (Wardhani dan Sulistyani, 2012). e. Uap Amonia Merupakan deteksi semprot untuk golongan flavonoid. Cara mengaplikasikan metode ini terhadap KLT yaitu dengan mengamati warna fluoresensi plat silika gel GF 254 di bawah sinar UV 254 nm sebelum dan sesudah penambahan uap amonia. Penambahan uap amonia dilakukan dengan cara diuapi dengan amonia (Wijoyo, 2003). Adanya senyawa flavonoid dapat ditunjukkan dengan bercak warna kuning (Ristiningsih, 2009). D. Analisis Data Data hasil pengamatan berupa profil kromatografi lapis tipis dan hasil identifikasi golongan senyawa metabolit sekunder dianalisis secara deskriptif.