LAPORAN PRAKTIKUM PEWARNAAN SPORA BAKTERI Untuk memenuhi tugas mata kuliah Mikrobiologi yang diampu oleh Prof. Dr. Dra. Utami Sri Hastuti, M.Pd Oleh: Kelompok 5 S1 Pendidikan Biologi Offering A Annas Jannaatun Na im 130341603379 Ella Rahmawati Hamiatin 130341603400 Hanum Annisatuz Zuhroh 130341603394 Nanik Yuliyanti 130341603367 Nila Wahyuni 130341603392 Rosita Buana Putri 130341614825 JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI MALANG FEBRUARI 2014
Tanggal : 12 Februari 2014 Topik : Pewarnaan Spora Bakteri Tujuan : 1. Untuk memperoleh keterampilan melakukan pewarnaan spora bakteri 2. Untuk mengetahui ada atau tidak adanya spora bakteri DASAR TEORI Jenis-jenis bakteri tertentu, terutama yang tergolong dalam genus Bacillus dan Clostridium mampu membentuk spora. Spora yang dihasilkan di luar sel vegetatif (eksospora) atau di dalam sel vegetatif (endospora). Bakteri membentuk spora bila kondisi lingkungan tidak optimum lagi untuk pertumbuhan dan perkembangannya, misalnya: medium mengering, kandungan nutrisi menyusut dan sebagainya (Hastuti, 2012). Eksospora Beberapa spesies bakteri menghasilkan spora eksternal. Streptomyces, misalnya, meghasilkan serantaian spora (disebut konidia), yang disangga di ujung hifa, suatu filamen vegetatif. Proses ini serupa dengan proses pembentukan spora pada beberapa cendawan (Irianto, 2006). Endospora Spora pada bakteri adalah endospora, suatu badan yang refraktil terdapat dalam induk sel dan merupakan suatu stadium isrtirahat dari sel tersebut. Endospora memiliki tingkat metabolisme yang sangat rendah sehingga dapat hidup sampai bertahun-tahun tanpa memerlukan sumber makanan dari luar (Irianto, 2006). Pembentukan spora dapat dianggap sebagai suatu proses diferensiasi dari suatu siklus hidup dalam keadaan-keadaan tertentu. Hal ini berbeda dari peristiwa pembelahan sel karena tidak terjadi replikasi kromosom (Pelczar, 1986). Kemampuan menghasilkan spora memberi keuntungan ekologis pada bakteri, karena memungkinkan bakteri itu bertahan dalam keadaan buruk. Langkah-langkah utama di dalam proses pembentukan spora sebagai berikut :
1. Penjajaran kembali bahan DNA menjadi filamen dan invaginasi membran sel di dekat satu ujung sel untuk membentuk suatu struktur yang disebut bakal spora 2. Pembentukan sederet lapisan yang menutupi bakal spora, yaitu korteks spora diikuti dengan selubung spora berlapis banyak 3. Pelepasan spora bebas seraya sel induk mengalami lisis (Pelczar, 1986). Salah satu ciri endospora bakteri adalah susunan kimiawinya. Semua endospora bakteri mengandung sejumlah besar asam dipikolinat yaitu suatu substansi yang tidak terdeteksi pada sel vegetatif. Sesungguhnya, asam tersebut merupakan 5-10 % berat kering endospora. Sejumlah besar kalsium juga terdapat dalam endospora, dan diduga bahwa lapisan korteks terbuat dari kompleks asam dipikolinat peptidoglikan (Pelczar, 1986). Letak endospora di dalam sel serta ukurannya selama pembentukannya tidaklah sama bagi semua spesies sebagai contoh, beberapa spora adalah sentral yaitu dibentuk ditengahtengah sel yang lain terminal yaitu dibentuk di ujung dan yang lain lagi lateral yaitu dibentuk di tepi sel (Pelczar, 1986). Diameter spora dapat lebih besar atau lebih kecil dari diameter sel vegetatifnya. Dibandingkan dengan sel vegetatif, spora sangat resinten terhadap kondisi-kondisi fisik yang kurang menguntungkan seperti suhu tinggi dan kekeringan serta bahan-bahan kimia seperti desinfektan. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras (Hadioetomo, 1985). Berdasarkan struktur dan komponen kimia penyusun lapisan spora, spora bakteri tidak dapat dilihat tanpa pewarnaan. Spora dapat diamati setelah spora terwarnai dengan menggunakan pewarnaan spora (DITULIS SAMA NILA). Pewarnaan spora Schaeffer-Fulton dilakukan dengan menutup sediaan dengan larutan hijau malakit. Kemudian dengan hati-hati sediaan dipanaskan selama 3 menit dan didinginkan sebelum dicuci dengan air. Pemanasan menyebabkan warna hijau malakit meresap ke dalam endospora, selanjutnya sediaan diwarnai dengan safranin (DITULIS SAMA NILA). Bila pewarnaan spora bakteri ini berhasil dengan baik, maka sel vegetatif bakteri akan berwarna merah. Jika sel membentuk spora, maka spora hasil pewarnaan akan berwarna hijau (Hastuti, 2012).
ALAT DAN BAHAN Alat 1. Mikroskop 2. Kaca Benda 3. Mangkuk pewarna 4. Kawat penyangga 5. Pipet 6. Pinset 7. Lampu spiritus 8. Botol penyemprot Bahan 1. Aquades steril 2. Bikakan murni bakteri 3. Larutan Hijau Malakit 5 % 4. Larutan Safranin 0,5% 5. Kertas lensa 6. Korek api 7. Alkohol 70% 8. Lisol 9. Sabun cuci 10. Lap 11. Kertas tissue
CARA KERJA Disediakan kaca benda yang bersih, lalu dilewatkan di atas nyala api lampu spiritus Diteteskan setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut Secara aseptik diambil inokulum bakteri yang akan diperiksa, lalu diletakkan di atas tetesan aquades tersebut. Kemudian diratakan perlahan-lahan dan ditunggu sampai Dilakukan fiksasi yaitu sediaan dilewatkan mengering di atas nyala api lampu spiritus dengan cepat Diteteskan larutan Hijau Malakit di atas sediaan itu, lalu dipanaskan di atas nyala api lampu spiritus selama 3 menit. Sediaan dijaga agar tidak sampai mendidih atau mongering. Jika mengering ditambahkan tetesan larutan hijau malakit. Sediaan diletakkan di atas lewat penyangga di atas mangkuk pewarna, lalu dibiarkan sampai dingin Kelebihan larutan hijau malakit dicuci dengan air kran dalam botol penyemprot Larutan safranin diteteskan di atas sediaan, lalu dibiarkan selama 3 menit Kelebihan larutan safranin pada sediaan itu dicuci Sediaan dikeringkan dengan kertas penghisap dan diamati di bawah mikroskop
DATA HASIL PENGAMATAN No. Koloni Ada/ tidak ada spora Bentuk spora Letak spora Gambar 1. Ada Bulat Sentral 2. Tidak ada spora - - - ANALISIS DATA Praktikum pewarnaan spora pada kedua biakan bakteri menunjukkan hasil yang berbeda antara bakteri satu dengan bakteri yang lainnya. Setelah dilakukan pewarnaan spora terhadap koloni bakteri tersebut didapatkan hasil bahwa koloni bakteri satu memiliki spora berbentuk bulat dan terletak di tengah (sentral). Adanya spora bakteri ini ditandai dengan sel vegetatif bakteri berwarna merah dan spora berwarna hijau. Pada koloni bakteri dua tidak didapati adanya spora. PEMBAHASAN Pada pewarnaan spora bakteri ini digunakan pewarna hijau malakit 5% dan safranin 0,5%. Dalam prosesnya, larutan hijau malakit diteteskan di atas sediaan yang telah difiksasi kemudian dipanaskan. Pemanasan akan menyebabkan lapisan luar spora mengembang sehingga pori-pori dapat membesar dan zat warna (larutan hijau malakit) meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri. Proses selanjutnya adalah pendinginan, melalui pendinginan ini warna hijau akan melekat di dalam spora. Warna hijau malakit ini berfungsi sebagai indikator adanya spora bakteri. Sediaan yang telah didinginkan kemudian dicuci dengan air, pencucian ini bertujuan untuk menghilangkan kelebihan warna hijau malakit sehingga pewarna kedua (safranin) dapat meresap pada sel vegetatif. Adanya pewarnaan kedua ini menyebabkan sel vegetatif bakteri berwarna merah. Dari hasil pengamatan yang dilakukan dengan menggunakan mikroskop didapatkan bahwa pada koloni bakteri satu sel vegetatifnya berwarna merah dan terdapat warna hijau bulat di tengah-tengah bagian dalam sel. Hal ini menunjukkan bahwa koloni bakteri satu memiliki spora yang terletak di tengah (sentral) dan berbentuk bulat. Pada koloni bakteri dua didapatkan bahwa sel vegetatif berwarna merah tanpa adanya warna hijau di dalam sel
maupun diluar sel sehingga dapat disimpulkan bahwa koloni tersebut tidak memiliki spora. Dengan tidak ditemukannya spora pada koloni bakteri dua menunjukkan lingkungan tempat hidup bakteri tersebut masih optimum untuk pertumbuhan dan perkembangannya. DISKUSI 1. Apakah fungsi spora bagi bakteri? Jawab : Spora bakteri berfungsi untuk mempertahankan diri saat kondisi lingkungan tidak menguntungkan atau tidak optimum lagi bagi pertumbuhan dan perkembangannya, misalnya medium mengering, kandungan nutrisi menyusut dan sebagainya. 2. Mengapa diperlukan pemanasan dalam proses pewarnaan spora bakteri? jelaskan! Jawab : karena pemanasan dapat menyebabkan lapisan luar spora mengembang sehingga pori-pori dapat membesar dan memudahkan zat warna (larutan hijau malakit) meresap ke dalam dinding pelindung spora bakteri. KESIMPULAN Koloni bakteri pertama memiliki spora, hal ini ditunjukkan dengan adanya sel vegetatif yang berwarna merah dan di dalamnya terdapat bulatan warna hijau terletak di tengah-tengah sel, sehingga dapat disimpulkan berdasarkan letak sporanya termasuk dalam spora sentral sedangkan berdasarkan bentuk sporanya termasuk jenis spora bulat. Koloni bakteri kedua tidak memiliki spora, hal ini ditunjukkan dengan sel vegetatif bakteri berwarna merah dan tidak ada warna hijau di dalam sel maupun di luar sel.
DAFTAR PUSTAKA Hadioetomo, R.S. 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta : PT. Gramedia Hastuti, S.U. 2012. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Malang : UMM Press Irianto, K. 2006. Mikrobiologi Jilid I. Bandung : Yrama Widya Pelczar, M.J. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Jakarta: UI Press