digilib.uns.ac.id BAB III METODE PENELITIAN A. Rancangan Penelitian Pada metode difusi, digunakan 5 perlakuan dengan masing-masing 3 ulangan meliputi pemberian minyak atsiri jahe gajah dengan konsentrasi 100%, klindamisin 0,5% sebagai kontrol positif, serta CMC 0,1%; DMSO; dan media nutrient broth (NB) steril yang diteteskan pada kertas cakram sebagai kontrol negatif. Sedangkan pada metode dilusi dilakukan 11 perlakuan yang meliputi 8 konsentrasi minyak atsiri jahe gajah (0,03%, 0,06%, 0,12%, 0,23%, 0,46%, 0,92%, 1,85% dan 3,7%), klindamisin 0,5% sebagai kontrol positif, serta media NB steril dan suspensi bakteri S. epidermidis sebagai kontrol negatif. B. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2013 sampai Desember 2013 bertempat di Laboratorium Jurusan Biologi FMIPA dan Laboratorium Jurusan Kimia FMIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta. C. Bahan dan Alat 1. Bahan Biakan murni S. epidermidis yang diisolasi dari kulit dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta, rimpang jahe gajah berumur 7 bulan dari Jumantono yang diidentifikasi di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) 18
digilib.uns.ac.id 19 Tawangmangu, media nutrient broth (NB), media nutrient agar (NA), akuades, kertas saring, vaselin, alkohol 70%, natrium sulfat anhidrat (Na 2 SO 4 ), alumunium foil, carboxyl methyl cellulose (CMC), dimethyl sulfoxide (DMSO) dan klindamisin. 2. Alat Jarum ose, batang degalsky, tabung reaksi, inkubator, lemari pendingin, erlenmeyer 250 ml, incubator shaker, laminar air flow (LAF), cawan petri, bunsen, mikropipet 100-1000 µl, mikropipet 20-200 µl, timbangan analitik, satu set alat destilasi Stahl, mantel pemanas, gelas ukur, gelas beker, hot plate, magnetic stirrer, botol flakon, bak, pompa air, jangka sorong, rak tabung reaksi, cotton bud, pinset dan spektrofotometer. D. Cara Kerja 1. Destilasi Minyak Atsiri Jahe Gajah (Zingiber officinale var. Roscoe) Rimpang jahe segar yang telah dicuci kemudian dipotong dengan ketebalan 7-8 mm untuk memperlancar proses destilasi Stahl. Kontak langsung dengan sinar matahari sangat dihindari untuk mencegah penguapan dan kerusakan minyak atsiri. Selanjutnya, potongan rimpang jahe ditimbang sebanyak 150 gram dan dimasukkan ke dalam labu alas bulat bersama dengan ±1000 ml akuades sampai semua bahan terendam. Akuades berfungsi sebagai penyalur energi panas ke seluruh bagian bahan tanaman sehingga minyak atsiri dapat terkondensasi bersama uap air. Mantel pemanas dinyalakan dan destilasi dilakukan selama 3-6
digilib.uns.ac.id 20 jam pada suhu 95ºC hingga minyak atsiri jahe terekstraksi sempurna. Selama proses destilasi, volume air harus dijaga konstan dengan penambahan air sedikit demi sedikit. Penyulingan dihentikan apabila tidak terlihat lagi penambahan volume minyak. Destilat atau minyak atsiri yang diperoleh ditampung, kemudian natrium sulfat anhidrat (Na 2 SO 4 ) (1 liter minyak atsiri diberi 1-3 g Na 2 SO 4 anhidrat) ditambahkan untuk menyerap sisa air yang ada (Kurniawan et al., 2008). Minyak atsiri yang diperoleh kemudian disimpan dalam botol flakon sebelum digunakan dalam uji aktivitas antimikrobia. Rendemen minyak atsiri dihitung dengan rumus sebagai berikut: Rendemen (%) = volume minyak atsiri (ml) X 100 % berat bahan (gram) (Khabibi, 2011) 2. Penyiapan Biakan Bakteri Biakan murni S. epidermidis dibuat stok dengan menumbuhkan 1 ose bakteri pada 5 ml media NA miring kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC. Bakteri yang terbentuk menunjukkan adanya pertumbuhan (Miksusanti et al., 2011). Sebelum digunakan, bakteri harus diremajakan terlebih dahulu dalam media nutrient broth (NB). Proses regenerasi diawali dengan mencelupkan 1 ose S. epidermidis ke dalam erlenmeyer berisi 10 ml media NB dan diinkubasi pada incubator shaker selama 5-14 jam pada suhu 30ºC dengan kecepatan putaran 200 rpm. Kultur bakteri yang semula jernih akan berubah menjadi keruh yang menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri setelah masa inkubasi.
digilib.uns.ac.id 21 3. Pembuatan Kurva Standar Bakteri Kurva standar bakteri dibuat untuk mengkonversikan nilai OD terhadap jumlah bakteri. Kurva standar didapat dari hubungan antara nilai absorbansi dan jumlah bakteri per ml. Sebanyak 5 ml S. epidermidis yang telah diremajakan, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 ml media NB dan selanjutnya dinyatakan sebagai pengenceran 1. Kemudian, pengenceran bertingkat dilakukan dengan cara memindahkan 5 ml biakan dari pengenceran sebelumnya ke tabung pengenceran berikutnya yang telah berisi 5 ml media NB hingga diperoleh pengenceran 1/2, 1/4, 1/8 dan 1/16. Masing-masing tabung reaksi diukur nilai OD-nya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm (Hamdiyati et al., 2008). Setelah nilai OD diketahui, 1 ml kultur dari faktor pengenceran 1/4 diambil 1 ml, dimasukkan ke dalam 9 ml garam fisiologis 0,85% kemudian dihomogenkan dengan vortex dan dinyatakan sebagai pengenceran 10-1. Kemudian, 1 ml kultur dari pengenceran sebelumnya (10-1 ) dimasukkan ke dalam 9 ml garam fisiologis 0,85%, dihomogenkan dengan vortex dan dinyatakan sebagai pengenceran 10-2. Satu ml kultur dari pengenceran 10-2 dimasukkan ke dalam 9 ml garam fisiologis 0,85%, kemudian dihomogenkan dengan vortex dan dinyatakan sebagai pengenceran 10-3. Satu ml kultur dari pengenceran 10-3 dimasukkan ke dalam 9 ml garam fisiologis 0,85%, dihomogenkan dengan vortex dan dinyatakan sebagai pengenceran 10-4. Satu ml kultur dari pengenceran 10-4 dimasukkan ke dalam 9 ml garam fisiologis 0,85%, dihomogenkan dengan vortex dan dinyatakan sebagai pengenceran 10-5. Masingmasing pengenceran diambil 100 µl, kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri
digilib.uns.ac.id 22 yang berisi media NA padat dan diratakan dengan batang degalsky. Percobaan ini dilakukan sebanyak 2 ulangan, kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Setelah 24 jam, jumlah bakteri yang berkisar antara 30-300 koloni dihitung. Jumlah bakteri yang diperoleh dari faktor pengenceran 1/4, selanjutnya digunakan untuk menentukan jumlah bakteri pada faktor pengenceran 1, 1/2, 1/8 dan 1/16. Jumlah bakteri pada pengenceran 1/2 didapatkan dari dua kali jumlah bakteri pada pengenceran 1/4, sedangkan jumlah bakteri pada pengenceran 1/8 didapatkan dari setengah jumlah bakteri pada pengenceran 1/4 begitu seterusnya. Hasil perhitungan koloni dan pengukuran OD yang diperoleh, kemudian dialurkan sebagai kurva dengan sumbu X menyatakan jumlah sel bakteri dan sumbu Y menyatakan nilai OD untuk mendapatkan persamaan regresi y=ax+b. Kurva yang didapatkan selanjutnya di intercept untuk mendapatkan bentuk kurva yang linear. 4. Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri Kurva pertumbuhan dibuat untuk mengetahui waktu bakteri tersebut mengalami pertumbuhan dengan cepat yaitu pada fase logaritmik. Pada fase tersebut, kebutuhan nutrisi bakteri terpenuhi secara optimal sehingga bakteri dapat merespons dengan baik berbagai pengaruh faktor luar yang mengenainya. Pembuatan kurva pertumbuhan ini diawali dengan meremajakan bakteri S. epidermidis. Proses tersebut dilakukan dengan cara memasukkan 1 ose bakteri S. epidermidis ke dalam 10 ml media NB yang diinkubasi dalam incubator shaker selama 24 jam pada suhu 30ºC dengan kecepatan 200 rpm. Setelah itu, 5 ml kultur bakteri yang telah diremajakan dimasukkan ke dalam 95 ml media NB dan diukur absorbansinya setiap 2 jam sekali sampai fase stasioner pada panjang gelombang
digilib.uns.ac.id 23 570 nm. Proses ini bertujuan untuk mencari nilai OD bakteri yang sesuai dengan kepadatan 10 6-10 8 sel bakteri/ml (Hamdiyati et al., 2008). 5. Metode Difusi Cakram Media NA steril dituang dalam cawan petri masing-masing sebanyak 10 ml dan dibiarkan sebentar hingga memadat. Media yang telah padat selanjutnya diinokulasi suspensi bakteri dengan kepadatan 10 6 sel bakteri/ml menggunakan cotton bud steril. Kemudian, kertas cakram berdiameter 6 mm yang telah ditetesi minyak atsiri jahe gajah dengan konsentrasi 100%, klindamisin 0,5% sebagai kontrol positif, serta CMC 0,1%; DMSO dan media nutrient broth (NB) steril yang diteteskan pada kertas cakram steril sebagai kontrol negatif masing-masing sebanyak 5 µl ditempelkan pada media yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. CMC 0,1% digunakan sebagai pelarut antibiotik klindamisin. Selanjutnya, seluruh cawan petri disimpan dalam lemari pendingin selama 2 jam supaya difusi ekstrak dapat berjalan dengan sempurna, dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam dan dilakukan sebanyak 2 ulangan. Hasil inkubasi akan menunjukkan adanya zona bening di sekitar kertas cakram yang merupakan zona hambat dan dapat diukur menggunakan jangka sorong (Dewi, 2010). 6. Pembuatan Seri Konsentrasi Minyak Atsiri Jahe Gajah Larutan stok dengan konsentrasi 100% didapatkan dengan mengambil 2 ml minyak atsiri jahe gajah. Pengenceran konsentrasi minyak atsiri jahe dilakukan dengan mengambil 1 ml larutan stok kemudian ditambah dengan 1 ml DMSO untuk mendapatkan larutan dengan konsentrasi 50%. Satu ml larutan hasil (50%) dimasukkan ke dalam tabung reaksi baru dan ditambahkan 1 ml DMSO sehingga
digilib.uns.ac.id 24 diperoleh larutan dengan konsentrasi 25%. Cara yang sama juga dilakukan untuk mendapatkan hasil pengenceran 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56% dan 0,78% sebagai pengenceran terakhir (Yuhana et al., 2010). 7. Uji MIC Delapan tabung reaksi yang telah berisi 5 ml media NB steril, kemudian ditambah dengan 200 µl suspensi bakteri dengan kepadatan 10 6 sel bakteri/ml dan 200 µl larutan minyak atsiri jahe gajah dengan konsentrasi akhir 0,03%; 0,06%; 0,12%; 0,23%; 0,46%; 0,92%; 1,85% dan 3,7%. Selanjutnya, optical density (OD) bakteri sebelum dan sesudah inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm. MIC ditentukan dengan membandingkan OD bakteri sebelum dan sesudah masa inkubasi. Jika selisih OD yang diperoleh kurang dari atau sama dengan nol ( 0), maka minyak atsiri jahe kemungkinan bersifat bakteriostatik/efektif menghambat pertumbuhan bakteri yang ditunjukkan dengan tidak adanya kekeruhan pada kultur. Hal ini dikarenakan medium yang keruh menandakan bahwa masih terdapat bakteri yang tumbuh (Yuhana et al., 2010). Pengukuran OD juga dilakukan terhadap media NB steril dan suspensi bakteri S. epidermidis sebagai kontrol negatif serta klindamisin 0,5% sebagai kontrol positif.
digilib.uns.ac.id 25 E. Analisis Data Analisis data dilakukan secara deskriptif dengan membandingkan diameter zona hambat yang terbentuk antar perlakuan serta nilai minimum inhibitory concentration (MIC) minyak atsiri jahe gajah terhadap S. epidermidis. Semakin besar diameter zona hambat, maka aktivitas antibakteri dari minyak atsiri jahe gajah juga semakin kuat.