BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini menggunakan metode eksperimental laboratorium dengan rancangan acak lengkap (RAL) atau completely randomized design yang terdiri dari 4 perlakuan dan 3 kontrol, positif, negatif dan perlakuan dengan pengulangan sebanyak 4 kali. Rancangan acak lengkap merupakan jenis rancangan percobaan yang paling sederhana. Metode ini dipilih karena satuan percobaan yang digunakan bersifat homogen atau tidak ada faktor lain yang mempengaruhi respon di luar faktor yang diteliti. Selain itu, percobaan ini dilakukan di laboratorium sehingga faktor luar yang dapat mempengaruhi percobaan dapat dikontrol. Hewan uji diujikan dengan variasi injeksi berupa kontrol negatif, kontrol positif, dan perlakuan. Kontrol negatif berupa aqua pro injeksi, kontrol positifnya berupa injeksi tramadol dan perlakuan berupa injeksi tramadol yang dilanjutkan dengan injeksi ranitidin. Pengumpulan data dilakukan secara langsung oleh peneliti. Pengolahan data dilakukan dengan uji kuantitatif terhadap jumlah respon mencit terhadap rangsang panas yang diberikan. Penyajian data dilakukan secara deskriptif disertai dengan tabel, narasi, dan pembahasan serta diambil kesimpulan penelitian. 23
24 B. Variabel Penelitian Variabel bebas Variabel tergantung Variabel terkendali : Pemberian ranitidin : Efek analgetik tramadol : Hewan uji (jenis kelamin, berat badan), metode uji (suhu rangsang panas), pembuatan larutan sediaan, kondisi perlakuan mencit, cara pemberian larutan sediaan. C. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spuit injeksi 1 ml (Terumo ), gelas beker (Pyrex ), labu ukur (Pyrex ), gelas ukur (Pyrex ), pipet ukur (Pyrex ), hotplate (Cimarec ), stopwatch, panci alumunium, dan kandang mencit. Bahan yang diperlukan secara keseluruhan berupa bahan tramadol ampul, ranitidin ampul, dan aqua pro injeksi yang diperoleh dari RSUD Karanganyar. Hewan uji yang digunakan adalah mencit jantan galur Balb/c sebanyak 12 ekor. Mencit jantan galur Balb/c ini dapat digunakan untuk pengujian efek analgetik sentral dengan menggunakan metode rangsang panas atau hotplate (Widhaningtyas, 2013). Mencit yang digunakan sebagai kontrol negatif, kontrol positif, dan perlakuan masing-masing digunakan sebanyak empat ekor. Mencit didapatkan dari Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret dengan berat rata-rata mencit antara 20-30 gram dan telah dikondisikan terlebih dahulu selama satu minggu dengan diberi makan dan minum dan dipuasakan terlebih dahulu selama ±11 jam sebelum dilakukan pengujian untuk menyamakan kondisi mencit
25 dan mengurangi variasi kondisi yang mungkin terjadi. Mencit diberi pakan berupa pelet jagung yang didapatkan dari toko pakan ternak di daerah Badranasri, Karanganyar serta diberi minum berupa air putih matang. Kontrol negatif yang digunakan berupa larutan aqua pro injection, kontrol positif berupa tramadol dengan dosis 0,18 mg/20 gram berat mencit sebanyak 0,5 ml, dan perlakuan berupa tramadol dengan dosis 0,18 mg/20 gram berat mencit sebanyak 0,25 ml yang kemudian juga diinjeksikan kembali Ranitidin secara intravena pada vena ekor mencit dengan dosis 0,13 mg/20 gram berat mencit sebanyak 0,25 ml. D. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Farmakologi Fakultas MIPA dan Laboratorium Farmasetika Fakultas MIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta bulan Februari-Juni 2016. E. Jalannya Penelitian 1. Perlakuan Mengkondisikan Mencit. Mencit diberi makan, minum, dihindarkan dari stress dan diatur dalam kondisi yang sama selama satu minggu, kemudian sebelum dilakukan pengujian dipuasakan dulu selama ±11 jam. Ini bertujuan agar kondisi mencit seragam dan tidak bervariasi, yang kemungkinan dapat mempengaruhi hasil akhir data pengujian. Kemudian mencit diberi nomor sebagai tanda untuk membedakan satu dengan yang lainnya.
26 2. Pengelompokan Hewan Uji Mencit yang akan dilakukan pengujian dikelompokkan terlebih dahulu menjadi 3 kelompok yakni kontrol negatif, kontrol positif, dan perlakuan dengan masing-masing kontrol berjumlah 4 ekor mencit. Kontrol negatif yang digunakan adalah aqua pro injection. Kontrol negatif berfungsi untuk membuktikan bahwa tidak ada efek analgetik yang ditimbulkan dengan pemberian aqua pro injection. Kontrol positif yang digunakan adalah tramadol injeksi. Karena obat ini merupakan obat salah satu obat analgetik yang dapat digunakan untuk mengobati pasien dengan nyeri derajat sedang keatas. Kontrol positif berfungsi sebagai pembanding terhadap efek analgetik pada perlakuan. Perlakuan yang digunakan adalah pemberian tramadol injeksi yang diikuti dengan pemberian ranitidin injeksi. Perlakuan berfungsi untuk mengetahui pengaruh pemberiannya terhadap kontrol positif. 3. Perhitungan Dosis. Konversi dosis dari manusia ke mencit dilakukan untuk menentukan dosis yang sesuai pada mencit untuk menghasilkan efek.
27 Konversi dosis dilakukan dengan perhitungan sebagai berikut: Tramadol Dosis manusia = 100mg/50kg BB Faktor konversi dosis mencit (20gr) pada manusia (70kg) = 0,0026 Perhitungan : Dosis mencit = 50 kg x 100mg x 0,0026 = 0,18mg/20gram 70 mencit Dosis tramadol injeksi = 100mg/2ml Maka, tramadol injeksi yang digunakan 0,18mg x 0,0036 ml = 100mg 2ml Ranitidin Dosis Manusia = 50mg (@6-8jam) Faktor konversi dosis mencit (20 gr) pada manusia (70 kg) = 0,0026 Perhitungan : Dosis mencit = 50mg x 0,0026 = 0,13mg/20gram mencit Dosis ranitidin injeksi = 50mg/2ml Maka, ranitidin injeksi yang digunakan 0,13mg x 0,0052ml = 50mg 2ml 4. Pembuatan Larutan Stok Pengenceran dilakukan karena sampel yang jumlahnya sangat sedikit sehingga perlu diencerkan untuk menghindari kesalahan pada saat pengambilan sediaan. Pengenceran dilakukan dengan menggunakan aqua pro injection.
28 Pengenceran dilakukan dengan perhitungan sebagai berikut: Tramadol Dosis tramadol untuk manusia: 100mg/2ml = 50mg/1ml Diambil 1 ml 50mg/ml diberi aqua p.i. ad 100 ml 50mg/100ml = 0,5mg/ml Ranitidin Dosis ranitidin untuk manusia: 50mg/2ml = 25mg/ml Diambil 1 ml 25mg/ml diberi aqua p.i. ad 100ml 25mg/100ml = 0,25mg/ml Larutan stok ini nantinya akan digunakan untuk penginjeksian intravena pada mencit. Dosis yang diberikan akan disesuaikan dengan berat badan mencit yang digunakan dengan cara diencerkan. 5. Pemberian Obat pada Hewan Uji Pemberian obat pada hewan uji dilakukan dengan cara injeksi secara intravena pada bagian pangkal vena ekor mencit. Penginjeksian disesuaikan antara injeksi yang diberikan dengan tanda yang sudah ada untuk menghindari kekeliruan. Untuk mencit dengan kontrol positif diinjeksikan tramadol, kontrol negatif diinjeksikan aqua pro injeksi, dan perlakuan diinjeksikan tramadol terlebih dahulu lalu diinjeksikan ranitidin. 6. Pengamatan Efek Analgetik Pengamatan efek analgetik dengan metode rangsang panas dilakukan dengan menggunakan hotplate yang telah diatur pada suhu 55 o C. Mencit kemudian diletakkan pada panci alumunium diatas hotplate dan dihitung
29 banyaknya respon mencit terhadap panas. Pada penelitian uji efek analgetik dengan metode rangsang panas oleh Ponggele (2013), digunakan jeda waktu 30 menit. Sehingga kali ini peneliti menggunakan jeda waktu 15 menit untuk melihat kemungkinan yang lebih jelas dari onset obat yang memberikan efek analgetik.respon mencit dihitung dari banyaknya mencit menjilat kaki dan melompat pada menit ke 15, 30, 45, 60, 75, 90. 105, dan 120 menit. Dan pada perlakuan setelah diberi tramadol dan ranitidin, dihitung kembali respon mencitnya dengan jeda waktu yang sama. F. Pengolahan dan Analisis Data Data yang diperoleh akan diolah dengan menggunakan aplikasi komputer SPSS (Statistical Package for the Social Science) 16.0 for untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan yang signifikan antara kontrol negatif, kontrol positif, dan perlakuan pada pengujian. Data yang didapatkan pertama-tama dicari terlebih dahulu normalitasnya untuk mengetahui persebaran data yang merata atau tidak. Untuk mencari normalitas data digunakan metode Shapiro-Wilk karena jumlah data yang ada berjumlah kurang dari 50 data. Jika persebaran data tersebut merata yang ditandai dengan signifikansi >0.05, dapat dikatakan data tersebut termasuk data parametrik, sehingga bisa dilanjutkan dengan uji One Way ANOVA, T-test, Z-test, dan Pearson Correlation. Jika data yang didapatkan tidak parametrik mata dilanjutkan dengan uji Chi-square, Median test, dan Friedman test (Supriana et al., 2010).
30 Kemudian dilakukan uji homogenitas untuk mengetahui beberapa varian populasi adalah sama atau tidak. Uji ini dilakukan sebagai prasyarat dalam analisis independent sample t-test dan ANOVA. Jika nilai signifikansi > 0,05 maka dapat dikatakan bahwa varian dari dua atau lebih kelompok data adalah sama. Namun jika signifikansi >0,05 maka dikatakan bahwa varian dari kelompok tersebut adalah berbeda. Kemudian jika data tersebut terdistribusi normal dan homogen maka dapat dilakukan analisis One Way ANOVA untuk mengetahui ada atau tidaknya perbedaan yang signifikan antara kontrol positif, kontrol negatif, dan perlakuan yang menunjukkan bahwa obat yang diberikan memberikan efek. Uji One Way ANOVA merupakan analisis variansi komparabel dan digunakan untuk mengkaji/mendeterminasi apakah rata-rata hitung (mean) dari tiga atau lebih populasi sama atau tidak. Dalam uji ANOVA, bukti sampel diambil dari setiap populasi yang sedang dikaji. Data-data yang diperoleh dari sampel tersebut digunakan untuk menghitung statistik sampel. Distribusi sampling yang digunakan untuk mengambil keputusan statistik, yakni menolak atau menerima hipotesis nol (H0) (Sugiharto, 2009). Jika signifikansi ANOVA menunjukkan angka <0,05 maka obat yang diberikan berarti telah memberikan efek.
31 G. Diagram Alir Cara Kerja Mencit Dikondisikan 1 minggu Mencit terkondisi Diinjeksi secara i.v. Ranitidin dan tramadol Dikonversi dosis dan pengenceran Larutan injeksi i.v. Kontrol positif : tramadol Kontrol negatif : Aqua p.i. Perlakuan : tramadol + ranitidin Dilakukan Rangsang panas dengan meletakkan mencit pada hotplate pada suhu 55 o C Diamati Respon mencit dalam menjilat kaki atau melompat karena rangsang panas pada menit ke 15,30,45,60,75,90,105, dan 120. SPSS metode One Way ANOVA Didapatkan data dan diolah Gambar 1. Diagram alir cara kerja