95 RINGKASAN Aterosklerosis merupakan penyebab kematian utama di negara berkembang dan melalui proses yang kompleks, melibatkan faktor genetik, faktor lingkungan dan berbagai tipe sel yang saling berpengaruh satu dengan yang lain. Diduga, lesi aterosklerotik diawali oleh adanya kerusakan sel-sel endotelia pembuluh darah, maka banyak penelitian dilakukan sebagai upaya mengetahui mekanisme yang bertanggung jawab terhadap terbentuknya lesi awal tersebut. Konsumsi makanan lemak jenuh dalam jumlah tinggi secara terus menerus merupakan faktor utama yang dapat meningkatkan kadar kolesterol dan trigliserida dalam plasma yang menyebabkan hiperlipidemia. Hiperlipidemia dalam jangka panjang akan menyebabkan aterosklerosis. Aterosklerosis merupakan penyakit arterial yang ditandai dengan penebalan secara parsial atau menyeluruh dinding pembuluh darah karena akumulasi lipid yang disertai dengan pembentukan jaringan fibrosa, kalsifikasi yang berhubungan dengan perubahan tunika intima. Penelitian terdahulu telah menjelaskan bahwa aterosklerosis berhubungan dengan peningkatan LDL. Senyawa CRP merupakan suatu protein fase akut utama, telah dihubung-hubungkan dengan kejadian dan beratnya aterosklerosis. Protein CRP ini juga telah digunakan untuk memprediksi kejadian penyakit kardiovaskuler dalam beberapa studi. Sampai saat ini para ahli dan peneliti masih terus berusaha mencari cara untuk mengurangi atau menormalkan kadar kolesterol dalam darah. Salah satu cara alternatif yang digunakan yaitu menambah konsumsi makanan yang mengandung serat kasar yaitu chitosan. Hal ini 95
96 dikarenakan pada bagian cangkang (karapaks) udang banyak terkandung senyawa chitosan yang efektif menurunkan kadar kolesterol dalam darah. Dua puluh ekor tikus putih Sprague Dawley jantan, umur 1,5 bulan dipergunakan sebagai hewan coba. Tikus putih diadaptasikan selama 1 minggu dalam 1 kandang 1 ekor tikus percobaan dengan diberi pakan stándar (mengandung lemak normal 4,5%) dan minum secara ad libitum. Tikus putih kemudian dibagi menjadi 4 kelompok masing-masing kelompok terdiri 5 ekor. Kelompok I adalah kelompok kontrol, yaitu tikus putih yang diberi pakan mengandung lemak normal (4,5%) selama 3 bulan. Kelompok II adalah kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi (mengandung lemak 20%) selama 3 bulan. Kelompok III adalah kelompok tikus putih yang diberi pakan mengandung lemak tinggi (mengandung lemak 20%) dan diberi chitosan 180 mg/ kg BB/ hari dalam 2 ml aquades selama 3 bulan. Kelompok IV adalah tikus putih diberi pakan lemak tinggi (mengandung lemak 20%) selama 3 bulan, kemudian setelah 1 bulan perlakuan, hewan tersebut juga diberi chitosan 180 mg/ kg BB/ hari dalam 2 ml aquades selama 2 bulan. Pemberian chitosan dilakukan per oral dengan bantuan spuit injeksi 2,5 ml berkanula. Pada hari terakhir perlakuan, setiap tikus dipuasakan 12-14 jam. Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata menggunakan pipet kapiler hematokrit sebanyak 2 ml (untuk analisis profil lipoprotein). Selanjutnya hewan dikorbankan dan di ambil organ jantung beserta aorta kemudian dimasukkan dalam botol film yang berisi 10% neutral buffered formalin untuk pembuatan preparat histopatologis dan imunohistokimia. Pengukuran profil lipoprotein ditentukan dengan metode colorimetric enzymatic 96
97 dengan menggunakan cobas c reagents kits dan Roche/Hitachi cobas c systems automatically calculate. Jaringan aorta dan arteria koronaria diwarnai dengan Hematoksilin-Eosin untuk pemeriksaan plak ateroma. Pengamatan ekspresi CRP dalam aorta dan arteria koronaria dilakukan dengan metode imunohistokimia streptavidin-biotin, dengan menggunakan antibodi primer Rabbit polyclonal Anti-C Reactive Protein antibody Aminoterminal end-ab65842 dan Invitrogen Histostain- SP kits. Pada penelitian ini diperoleh hasil sebagai berikut: Rerata kadar kolesterol total masing-masing adalah: 1. Kelompok kontrol, yaitu tikus putih yang diberi pakan lemak normal selama 3 bulan sebesar 77,6 7,02 mg/dl, 2. Kelompok tikus putih (P1) yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan sebesar 147,2 2,77 mg/dl, 3. Kelompok tikus putih (P2) yang diberi pakan lemak tinggi + chitosan secara simultan sebesar 72,6 3,44 mg/dl, 4. Kelompok tikus putih (P3) yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan, kemudian setelah 1 bulan perlakuan, hewan tersebut juga diberi chitosan selama 2 bulan sebesar 74,4 3,78 mg/dl. Rerata kadar HDL masing-masing adalah: 1. Kelompok kontrol, yaitu tikus putih yang diberi pakan lemak normal selama 3 bulan sebesar 16,4 1,14 mg/dl, 2. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan sebesar 12,8 0,84 mg/dl, 3. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi + chitosan secara simultan selama 3 bulan sebesar 24,8 0,84 mg/dl, 4. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan, kemudian setelah 1 bulan 97
98 perlakuan, hewan tersebut juga diberi chitosan selama 2 bulan sebesar 19,2 0,84 mg/dl. Rerata kadar LDL masing-masing adalah: 1. Kelompok kontrol, yaitu tikus putih yang diberi pakan lemak normal selama 3 bulan sebesar 53,2 0,84 mg/dl, 2. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan sebesar 116,2 0,84 mg/dl, 3. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi + diberi chitosan secara simultan selama 3 bulan sebesar 33,4 1,14 mg/dl, 4. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan, kemudian setelah 1 bulan perlakuan, hewan tersebut juga diberi chitosan selama 2 bulan sebesar 48,6 1,14 mg/dl. Rerata rasio kadar LDL/HDL masing-masing adalah: 1. Kelompok kontrol, yaitu tikus putih yang diberi pakan lemak normal selama 3 bulan sebesar 3,25 0,17, 2. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan sebesar 9,11 0,48, 3. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi + chitosan secara simultan selama 3 bulan sebesar 1,35 0,038, 4. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan, kemudian setelah 1 bulan perlakuan, hewan tersebut juga diberi chitosan selama 2 bulan sebesar 2,53 0,057. Rerata konsentrasi apoprotein A masing-masing adalah: 1. Kelompok kontrol, yaitu tikus putih yang diberi pakan lemak normal selama 3 bulan sebesar 8,24 0,63 mg/dl, 2. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan sebesar 2,64 0,53 mg/dl, 3. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak 98
99 tinggi + chitosan secara simultan selama 3 bulan sebesar 6 0,51 mg/dl, 4. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan, kemudian setelah 1 bulan perlakuan, hewan tersebut juga diberi chitosan selama 2 bulan sebesar 6,1 0,27 mg/dl. Rerata konsentrasi apoprotein B masing-masing adalah: 1. Kelompok kontrol, yaitu tikus putih yang diberi pakan lemak normal selama 3 bulan sebesar 3,92 0,54 mg/dl, 2. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan sebesar 6,94 0,48 mg/dl, 3. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi + chitosan secara simultan selama 3 bulan sebesar 2,96 0,20 mg/dl, 4. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan, kemudian setelah 1 bulan perlakuan, hewan tersebut juga diberi chitosan selama 2 bulan sebesar 3 0,16 mg/dl. Rerata rasio konsentrasi apoprotein B/apoprotein A masing-masing adalah: 1. Kelompok kontrol, yaitu tikus putih yang diberi pakan lemak normal selama 3 bulan sebesar 0,47 0,04, 2. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan sebesar 2,71 0,51, 3. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi + chitosan secara simultan selama 3 bulan sebesar 0,49 0,03, 4. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan, kemudian setelah 1 bulan perlakuan, hewan tersebut juga diberi chitosan selama 2 bulan sebesar 0,49 0,06. 99
100 Rerata tebal dinding arteri koronaria masing-masing adalah: 1. Kelompok kontrol, yaitu tikus putih yang diberi pakan lemak normal selama 3 bulan sebesar 18,94 2,16 µm, 2. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan sebesar 31,02 2,59 µm, 3. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi + chitosan secara simultan selama 3 bulan sebesar 19,76 0,42 µm, 4. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan, kemudian setelah 1 bulan perlakuan, hewan tersebut juga diberi chitosan selama 2 bulan sebesar 20,9 2,37 µm. Rerata diameter lumen arteria koronaria masing-masing adalah: 1. Kelompok kontrol, yaitu tikus putih yang diberi pakan lemak normal selama 3 bulan sebesar 89,87 4,85 µm, 2. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan sebesar 82,28 6,11 µm, 3. Kelompok tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi + chitosan secara simultan selama 3 bulan sebesar 110,6 8,25 µm, 4. Kelompok tikus putih diberi pakan lemak tinggi selama 3 bulan, kemudian setelah 1 bulan perlakuan, hewan tersebut juga diberi chitosan selama 2 bulan sebesar 86,86 4,23 µm. Pengamatan preparat histopatologis aorta dengan pewarnaan hematoksilineosin, yaitu: 1. Aorta tikus putih yang diberi pakan normal (K) menunjukkan gambaran normal, 2. Aorta tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi (P1) menunjukkan gambaran plak ateroma, 3. Aorta tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi + chitosan secara simultan (P2) menunjukkan gambaran normal, hampir sama 100
101 dengan aorta tikus putih yang diberi pakan normal (K), 4. Aorta tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi, kemudian setelah 1 bulan perlakuan, hewan tersebut juga diberi chitosan (P3) ada beberapa yang menunjukkan gambaran normal dan gambaran plak ateroma. Pengamatan preparat histopatologis arteria koronaria dengan pewarnaan hematoksilin-eosin, yaitu: 1. Arteria koronaria tikus putih yang diberi pakan normal (K) menunjukkan gambaran normal, 2. Arteria koronaria tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi (P1) menunjukkan gambaran normal, 3. Arteria koronaria tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi + chitosan secara simultan (P2) menunjukkan gambaran normal, hampir sama dengan arteria koronaria tikus putih yang diberi pakan normal (K), 4. Arteria koronaria tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi, kemudian setelah 1 bulan perlakuan, hewan tersebut juga diberi chitosan (P3) menunjukkan gambaran normal. Hasil uji imunohistokimia dengan streptavidin-biotin terhadap ekspresi CRP aorta adalah negatif untuk semua perlakuan. Uji imunohistokimia Arteria koronaria tikus putih yang diberi pakan normal (K) adalah negatif. Gambaran imunohistokimia arteria koronaria tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi (P1) adalah positif. Uji imunohistokimia arteria koronaria tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi + chitosan secara simultan (P2) adalah negatif. Uji imunohistokimia arteria koronaria tikus putih yang diberi pakan lemak tinggi, kemudian setelah 1 bulan perlakuan, hewan tersebut juga diberi chitosan (P3) adalah positif. Uji imunohistokimia positif yaitu dengan terbentuknya warna coklat tua, hal ini berarti perlakuan pakan lemak 101
102 tinggi yang diberikan sudah menyebabkan peradangan pada arteria koronaria yang menghasilkan CRP. Berdasarkan keseluruhan hasil penelitian ini dapat disimpulkan, bahwa pakan lemak tinggi adalah faktor utama penyebab aterosklerosis, CRP beraksi dalam kejadian awal terjadinya aterosklerosis, chitosan mampu mencegah terjadinya plak ateroma. 102