13 BAHAN DAN METODE Tempat dan waktu Penelitian ini dilaksanakan di Desa Ciburuy, Kecamatan Cigombong, Kabupaten Bogor serta di Laboratorium Bakteriologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung antara bulan Oktober 2010 Maret 2011. Bahan dan alat Bahan yang digunakan yaitu benih kedelai dengan dua varietas (Anjasmoro dan Gepak Kuning), biakan PGPR (strain Bacillus subtilis AB 89 dan Pseudomonas fluorescens RH4003), pupuk NPK, Furadan, serta beberapa isolat bakteri yang diisolasi dari perakaran oleh Tita Widjayanti, Mahasiswa Fitopatologi Pascasarjana Institut Pertanian Bogor (hasil belum dipublikasi). Alat yang digunakan adalah alat budidaya kedelai, serta alat isolasi bakteri. Tabel 1. Pelakuan penelitian Kombinasi perlakuan yang dilakukan pada penelitian ini ditampilkan pada Tabel 1 Kombinasi perlakuan yang dilakukan di lapangan Kombinasi Varietas Anjasmoro + Mulsa + PGPR Varietas Anjasmoro + Tanpa Mulsa + PGPR Varietas Anjasmoro + Mulsa + Tanpa PGPR Varietas Anjasmoro + Tanpa Mulsa + Tanpa PGPR Varietas Gepak Kuning + Mulsa + PGPR Varietas Gepak Kuning + Tanpa Mulsa + PGPR Varietas Gepak Kuning + Mulsa + Tanpa PGPR Varietas Gepak Kuning + Tanpa Mulsa + Tanpa PGPR Kode IAc IBc IAd IBd IIAc IIBc IIAd IIBd
14 Persiapan lahan dan penanaman kedelai Lahan petani di Desa Ciburuy, Kab. Bogor seluas 1344m 2 diolah menjadi 24 petakan. Masing - masing petak percobaan berukuran 7m x 8m. Dalam satu petak dibuat 7 guludan dengan ukuran 0,7m x 8m dan jarak antar guludan 0,3m. Disetiap guludan dibuat dua baris tanaman dengan jarak 40cm. Kedelai yang ditanam terdiri dari dua varietas yaitu Anjasmoro dan Gepak Kuning. Benih ditanam dengan cara ditugal dan jarak antar tanaman 20cm. Setiap lubang diisi dua butir benih dengan varietas yang sama. Disamping guludan dibuat parit kecil untuk alur pupuk NPK dengan komposisi 1:1:1. Aplikasi mulsa dan PGPR Perlakuan penggunaan mulsa jerami diberikan pada 12 petak percobaan. Jerami diletakkan diatas guludan hingga guludan tertutupi secara keseluruhan. Pemberian mulsa jerami dilakukan sebelum penanaman benih. Aplikasi PGPR dilakukan pada 12 petakan dengan cara menyiramkan 50ml suspensi PGPR (konsentrasi 10 7-10 8 cfu/ml) pada perakaran tanaman kedelai. Suspensi PGPR dibuat dengan cara menumbuhkan bakteri PGPR B. subtilis dan P. fluorescens RH4003 pada media King s B agar. Setelah diinkubasi selama 24 48 jam, sebanyak satu lup jarum ose penuh disuspensikan dalam 10 ml aquades steril yang akan menghasilkan biakan 10 8 10 9 cfu/ml. Dari suspensi tersebut diambil 10ml untuk diencerkan menjadi 100ml dengan jumlah bakteri 10 7-10 8 cfu/ml. Penyiraman dilakukan satu kali pada saat tanaman berumur 7 hari. Pengamatan pengaruh aplikasi mulsa dilakukan dengan menghitung tanaman yang terserang penyakit busuk pangkal batang. Pengamatan dilakukan dengan mengamati gejala penyakit yaitu daun sedikit demi sedikit layu, menguning dan terdapat hifa putih pada pangkal batang tanaman tersebut. Pengamatan dilakukan pada seluruh tanaman yang tumbuh pada lahan penelitian ditiap perlakuannya. Dari keseluruhan dilihat keparahan akibat cendawan Sclerotium rolfsii di lahan percobaan dengan menggunakan metode perhitungan persentase penyakit yang dilakukan pada tiap perlakuan yang diamati tiap minggunya:
15 P = Persentase insidensi penyakit (%) Data insidensi penyakit kemudian dibuat dalam bentuk grafik perkembangan penyakit. Total luas area yang ada di bawah kurva perkembangan penyakit (Area Under Diseases Progress Curve/AUDPC) dihitung dengan menggunakan rumus Van der Plank (1963) dalam Cook et al. (2006) yaitu : Y i+1 = Data pengamataan ke-i+1 t i+1 = Waktu pengamatan ke-i+1 Yi = Data pengamatan ke-1 ti = Waktu pengamatan ke-1 AUDPC = Area Under Diseases Progress Curve (% hari) Isolasi bakteri rizosfer Isolasi bakteri rizosfer dilakukan dengan mensuspensikan 10gram tanah kedalam 100ml air steril dalam erlenmeyer kemudian dikocok menggunakan shaker dengan kecepatan 300rpm selama 5menit atau hingga tercampur sempurna (homogen). Setelah itu dilakukan pengenceran secara berseri dengan mengambil 1ml suspensi lalu dicampurkan ke dalam tabung reaksi berisi 90ml aquadest steril hingga didapatkan pengenceran 10-10. Sebanyak 0,1ml (100µl) suspensi dari pengenceran berseri dengan konsentrasi 10-4, 10-6, 10-8, 10-10 untuk setiap contoh rizosfer kemudian disebar (plating) dengan menggunakan glass beads pada media Kitin, King s B dan TSA dalam cawan petri. Masing-masing perlakuan diulang 2 kali (duplo). Setelah diinkubasi selama 24 48 jam pada suhu kamar, koloni yang tumbuh diamati karakter morfologinya dan dimurnikan untuk uji antagonisme. Masing-masing isolat yang sudah murni selanjutnya disimpan untuk jangka panjang (± 1-2 tahun) dalam gliserol 10% pada suhu -20 0 C.
16 Isolasi cendawan patogen Sclerotium rolfsii Cendawan yang digunakan adalah cendawan yang menyerang tanaman kedelai di lahan pengamatan. Pengamatan insidensi penyakit dilihat dari keseluruhan tanaman yang ada disetiap petakan perlakuan. Batang kedelai yang terserang ditandai dengan adanya hifa putih atau sklerotia berwarna coklat pada pangkal batang. Tanaman dengan gejala tersebut dicabut untuk bahan isolasi. Batang kedelai tersebut dipotong 5cm dan dibasuh dengan desinfektan untuk membersihkan dari tanah dan mikroba yang lainnya. Potongan batang tersebut ditaruh di dalam cawan petri yang telah diberi tisu lembab, inkubasi selama 2 3 hari sampai hifa-hifa dari cendawan tersebut tumbuh dan memenuhi cawan petri atau terbentuk sklerotia. Kemudian dilakukan isolasi dengan menggunakan media PDA (Potato Dextrose Agar). Miselium cendawan diambil dengan jarum isolasi dan diletakkan pada permukaan medium PDA dalam cawan petri, kemudian diinkubasi selama 3 4 hari dalam suhu kamar sampai miselium cendawan memenuhi cawan petri. Cendawan dalam media inilah yang nantinya akan digunakan sebagai cendawan uji dalam uji antagonisme. Uji antagonisme pada cawan petri Patogen S. rolfsii dan isolat bakteri rizosfer ditumbuhkan bersama - sama pada media PDA. Miselium cendawan diletakkan pada permukaan medium dengan jarak 3cm dari tepi kanan cawan petri, sedangkan bakteri hasil isolasi digoreskan menggunakan jarum ose dengan jarak 3cm dari tepi sebelah kiri cawan petri. Jarak antara cendawan dengan bakteri adalah 3cm. Cawan petri diinkubasi dalam suhu ruangan selama 2 hari. Pengamatan dilakukan terhadap jari-jari koloni cendawan S. rolfsii. Persentase daya hambat bakteri terhadap S. rolfsii dihitung dengan rumus Fokkema (1976) dalam Rahaju (2007) sebagai berikut :
17 I = Persentase daya hambat (%) R1 = Jari-jari koloni S. rolfsii yang arahnya berlawanan dengan bakteri rizosfer R2 = Jari-jari koloni S. rolfsii yang arahnya menuju pusat bakteri R B 4 R cm A 4 Gambar 1 Cara pengukuran koloni S. rolfsii untuk menghitung persentase hambatan oleh mikroorganisme antagonis; R1. Jari-jari koloni cendawan yang tumbuh berlawanan kearah bakteri R2. Jari-jari koloni S. rolfsii yang tumbuh kearah bakteri. A. Inokulum bakteri rizosfer B. Inokulum S. rolfsii Analisis Data Data hasil percobaan di lapangan diolah menggunakan metode statistik Rancangan Faktorial dalam Rancangan Acak Kelompok dengan 3 faktor. Faktor pertama adalah jenis varietas dengan dua taraf, yaitu Anjasmoro dan Gepak Kuning. Faktor kedua adalah mulsa dengan dua taraf yaitu penggunaan mulsa dan tanpa penggunaan mulsa. Faktor yang ketiga adalah PGPR dengan dua taraf, yaitu menggunakan PGPR dan tidak menggunakan PGPR. Keseluruhan percobaan diulang sebanyak tiga kali secara kelompok. Percobaan yang dilakukan di laboratorium dianalisis menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan perlakuan berdasarkan jenis bakteri (jenis fluorescence, non-fluorescence, tahan panas, serta jenis kitin) dengan tiga kali ulangan dan satu kontrol di setiap perlakuannya. Kemudian kedua metode tersebut dianalisis dengan menggunakan Statistical Analysis System (SAS) versi 9.1.3. Perlakuan yang berbeda nyata diuji lanjut dengan uji selang berganda Duncan pada taraf nyata 5%.