III. METODE PENELITIAN A. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biocontrol, Divisi Research and Development, PT Gunung Madu Plantations (PT GMP), Kabupaten Lampung Tengah. Pembiakan dilaksanakan dari bulan Mei sampai Juli 2011. Sedangkan pengolahan dan analisis data dilaksanakan dari bulan Agustus 2011 sampai Mei 2012. B. Alat dan bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung plastik (ukuran 20 cm x 10 cm), cawan petri, gelas tabung ukuran 20 cm x 3 cm, gelas Erlenmeyer 1000 ml, tali, kertas saring, pisau, pinset, kantong plastik, nampan, alat tulis, kertas label, tissue, gunting dan perekat. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian adalah potongan batang tebu muda atau sogolan, pelepah daun tebu yang masih segar, bagasse yaitu sogolan tebu yang digiling dan dijemur, kapas, aquades, madu dengan konsentrasi 10% sebagai pakan parasitoid, media kacang hijau, larva penggerek batang, gulungan pelepah daun tebu, dan kokon parasitoid Cotesia flavipes yang diperoleh dari lapangan.
14 C. Metode Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dengan membiakkan beberapa generasi koloni parasitoid C. flavipes di laboratorium dengan mengumpulkan kokon (Gambar 1) parasitoid dari lapangan, menyiapkan inang, memelihara parasitoid, menginokulasikan parasitoid ke serangga inang, dan mengamati perkembangannya. Selanjutnya dilakukan pengamatan terhadap beberapa karakteristik biologi dari koloni-koloni C. flavipes yang berasal dari generasi berbeda, yaitu : hasil pembiakan di laboratorium generasi 7, generasi 5, dan koloni liar yang diambil dari lahan pertanaman tebu. Karakteristik biologi yang diamati adalah : jumlah kelompok kokon, jumlah imago, seks rasio jantan dan betina, dan lama hidup maksimum imago jantan dan betina. Gambar 1. Kelompok kokon C. flavipes diperoleh dari lahan PT GMP yang digunakan untuk starter pembiakan
15 Penelitian disusun dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan koloni generasi keturunan liar (G1), G5, dan G7 parasitoid C. flavipes berperan sebagai perlakuan dan setiap perlakuan diulang sebanyak lima kali. D. Pelaksanaan Penelitian 1. Pengumpulan Kelompok Kokon C. flavipes Pengumpulan kelompok kokon dilakukan dengan cara mengambil kelompok kokon dari pertanaman tebu yang terserang oleh hama penggerek batang Chilo sacchariphagus Bojer. Kelompok kokon yang diperoleh dari lapang disimpan di dalam kantung plastik untuk dibawa ke laboratorium. Selanjutnya kelompok kokon C. flavipes yang terkumpul dimasukkan ke dalam wadah tabung plastik (ukuran 20 cm x 10 cm) (Gambar 2) dan diamati selama dua hari. Gambar 2. Kelompok kokon C. flavipes dikumpulkan dalam tabung plastik untuk dibawa ke laboratorium
16 Untuk memastikan bahwa parasitoid C. flavipes berkembang dengan baik yang ditandai dengan perubahan warna kokon dari putih menjadi cokelat kehitaman. Kelompok kokon yang mulai berwarna hitam selanjutnya dipindahkan tabung gelas berukuran 20 x 3 cm (Gambar 3). Gambar 3. Kelompok kokon C. flavipes dimasukkan dalam tabung gelas untuk memastikan bahwa parasitoid berkembang dengan baik 2. Pembiakan C. sacchariphagus dan C. flavipes Penggerek batang tebu berkilat C. sacchariphagus (Lepidoptera: Pyralidae) yang dibiakkan di laboratorium digunakan untuk pengembangan dan inang musuh alami. Ngengat (imago penggerek batang tebu berkilat) diletakkan di dalam toples yang telah berisi pelepah daun tebu segar untuk dikawinkan (Gambar 4). Ngengat selanjutnya menghasilkan telur berwarna putih cerah dan menempel pada daun tebu secara berkelompok (Gambar 5). Telur C. sacchariphagus yang menempel pada daun diinfestasi selama dua hari. Dua hari kemudian telur-telur
17 dilepaskan dari pelepah daun tebu dan dipindahkan ke dalam cawan petri. Telur C. sacchariphagus yang ada pada cawan petri diinfestasikan kembali selama 2-3 hari, hingga telur berubah warna menjadi gelap dan siap diinfestasikan ke dalam media kacang hijau selama 15 hari (Gambar 6). Setelah diinfestasi dilakukan pengumpulan larva C. sacchariphagus yang selanjutnya dikumpulkan dan digunakan sebagai inang parasitoid C. flavipes (Gambar 7). Dalam pembiakan ini digunakan 20 larva C. sacchariphagus (inang) untuk setiap generasi dan diulang sebanyak lima kali, sehingga jumlah larva penggerek batang yang dibutuhkan adalah 100 ekor larva setiap generasi. Prosedur pembiakan disajikan pada bagan Gambar 8. Gambar 4. Wadah untuk memelihara dan mengawinkan ngengat yang telah berisi pelepah daun tebu segar
18 Gambar 5. Telur ngengat penggerek batang berwarna putih yang menempel pada daun tebu Gambar 6. Telur ngengat penggerek batang diinfestasikan ke dalam media kacang hijau selama 15 hari
19 Gambar 7. Larva C. sacchariphagus yang dikumpulkan digunakan sebagai inang parasitoid C. flavipes Ngengat C. sacchariphagus diletakkan di dalam wadah untuk dikawinkan Telur C. sacchariphagus diinfestasikan pada pelepah daun kemudian setelah dua hari dipindahkan ke dalam cawan petri Telur yang ada pada cawan petri diinfestasikan kembali selama 2-3 hari Setelah telur C. sacchariphagus berubah warna menjadi gelap kemudian diinfestasikan ke dalam media kacang hijau selama 15 hari Setelah 15 hari ulat (larva) C. sacchariphagus dikumpulkan Ulat (larva) C. sacchariphagus siap sebagai inang parasitoid Gambar 8. Bagan pembiakan penggerek batang tebu berkilat (C. sacchariphagus)
20 3. Perlakuan Pemarasitan C. sacchariphagus oleh Parasitoid C. flavipes Dari sejumlah kokon parasitoid yang telah terkumpul, beberapa kokon dipilih untuk dimasukkan ke dalam tabung gelas dan diberi pakan tetesan madu dengan konsentrasi 10%, dua hari kemudian kokon-kokon tersebut menetas (Gambar 9). Gambar 9. Kelompok kokon C. flavipes dalam tabung gelas yang diberi pakan tetesan madu dengan konsentrasi 10% Setelah menetas, tabung biakan yang berisi parasitoid dikumpulkan di tempat yang terang agar parasitoid aktif bergerak. Kain penutup tabung biakan dibuka perlahan-lahan untuk mempermudah proses inokulasi. Inokulasi dilakukan dengan mempersiapkan 20 larva C. sacchariphagus hasil dari pembiakan inang yang telah dilakukan. Setelah larva-larva tersebut siap, satu demi satu larva penggerek batang diambil dengan pinset dan kemudian diinfestasikan pada imago betina C. flavipes yang berada di dalam tabung. Satu larva penggerek batang diinokulasi dengan satu betina parasitoid (Gambar 10). Larva penggerek batang yang telah diinokulasi kemudian dikumpulkan dan selanjutnya dipindahkan ke
21 dalam tabung yang berisi media kacang hijau. Setiap tabung tersebut diisi dengan 20 larva C. sacchariphagus yang telah terinfestasi betina C. flavipes dan dipelihara selama tujuh hari (Gambar 11). Setelah tujuh hari, larva tersebut dipindahkan ke media gulungan pelepah daun kering yang dilapisi kapas. Dalam media tersebut juga diisi dengan larva C. sacchariphagus yang berjumlah 20 ekor dan kemudian dibiakkan selama lima hari (Gambar 12). Setelah lima hari, media gulungan pelepah daun kering dibuka dan diamati pupa C. flavipes yang berhasil muncul dari larva penggerek batang yang telah terparasit. Kemudian pupa tersebut dikumpulkan dan dihitung jumlah kelompok kokon yang dihasilkan. Setelah kurang lebih selama tiga hari, maka pupa C. flavipes akan berubah warna menjadi hitam kecokelatan sebagai tanda bahwa pupa tersebut akan menetas menjadi generasi yang baru. Selanjutnya pupa C. flavipes dipindahkan ke dalam tabung yang telah diberi tetesan madu dan ditutup dengan kain kasa untuk menjaga agar imago yang berhasil menetas tidak dapat keluar dari dalam tabung. Setelah pupa tersebut menetas, diamati imago C. flavipes yang berhasil muncul dan kemudian dihitung jumlah imago tersebut untuk menentukan seks rasio jantan dan betinanya (Gambar 13). Imago C. flavipes yang berada di dalam tabung hanya mendapatkan sumber makanan dari tetesan madu yang disediakan. Dengan sumber makanan yang terbatas, perkembangan imago C. flavipes diamati setiap hari dan dicatat berapa lama imago-imago tersebut dapat bertahan hidup. Perlakuan ini diterapkan pada setiap generasi dan semua ulangannya. Generasi yang digunakan dalam percobaan ini adalah generasi keturunan liar (G1), generasi ke-5 (G5), dan generasi ke-7 (G7).
22 Gambar 10. Parasitoid diinfestasikan pada inang (larva penggerek batang) Gambar 11. Larva penggerek batang dipelihara dalam tabung yang berisi media kacang hijau
23 Gambar 12. Larva C. sacchariphagus pada media gulungan pelepah daun kering Starter dipilih dari kelompok kokon yang baik Kokon dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diberi pakan madu dengan konsentrasi 10 % Parasitoid menetas dan melakukan perkawinan kurang lebih selama tiga Parasitoid diinfestasikan (inokulasi) pada larva penggerek batang (inang) Larva C. sacchariphagus dipindahkan ke dalam tabung yang berisi media kacang hijau dan dipelihara selama tujuh hari Larva C. sacchariphagus kemudian dipindahkan ke media gulungan pelepah daun kering dan dipelihara selama lima hari Pupa dikumpulkan dan dihitung Setelah pupa menetas, imago dihitung untuk menentukan seks rasio jantan dan betina Gambar 13. Bagan perlakuan pemarasitan C. sacchariphagus oleh C. flavipes.
24 4. Pengamatan Pengamatan dilakukan dalam beberapa tahap dengan mengamati : (1) Jumlah kelompok kokon : diamati dengan cara menghitung jumlah kelompok kokon yang terdapat pada tubuh inang terparasit. (2) Jumlah serangga dewasa (imago) : diamati dengan cara menghitung jumlah imago yang berhasil keluar dari kokon yang terdapat di dalam setiap tabung biakan. (3) Seks rasio jantan dan betina : ditentukan dengan cara menghitung jumlah C. flavipes jantan dan betina. Serangga jantan ditandai dengan antenanya yang berukuran lebih panjang daripada serangga C. flavipes betina. (4) Lama hidup maksimum serangga jantan dan betina dari parasitoid C. flavipes koloni generasi liar (G1), generasi ke-5 (G5), dan generasi ke-7 (G7). Lama hidup maksimum C. flavipes dari setiap generasi biakan ditentukan dengan cara mencatat lama hidup dari individu terakhir yang bertahan dari masingmasing tabung biakan. 5. Analisis Data Data yang diperoleh disusun dalam bentuk tabel, dan dianalisis dengan sidik ragam (ANOVA) yang dilanjutkan dengan uji perbandingan nilai tengah (BNT dengan taraf nyata α = 0,05) dengan menggunakan perangkat pengolah data SAS versi 6.12.0.1 (Sas Institute, 1989).