BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini termasuk ke dalam metoda penelitian eksperimental dimana di dalamnya terdapat perlakuan untuk memanipulasi objek penelitian dan diperlukan kontrol sebagai pembandingnya. Kontrol penelitian yang digunakan yaitu berupa objek penelitian yang tidak diberi perlakuan. B. Desain Penelitian Desain penelitian yang digunakan ialah Rancangan Acak Lengkap (RAL), dimana setiap perlakuan diberikan kondisi yang homogen sehingga diharapkan tidak ada faktor luar yang mempengaruhi aktivitas antibakteri ekstrak daun patikan kebo terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis. Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metoda difusi agar. Mengacu pada penelitian Ogbulie et al. (2007: 1544) yang menguji aktivitas antibakteri ekstrak daun patikan kebo terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi dan Bacillus subtilis pada konsentrasi 50, 100, 150, 200, dan 250 mg/ml, maka konsentrasi ekstrak daun patikan kebo yang digunakan dalam penelitian ini ialah 0, 50, 100, 150, 200, 250 dan 300 mg/ml. Selain itu, sebagai uji lanjutan untuk menentukan nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM), maka dilakukan pula pengenceran ekstrak hingga menjadi berbagai konsentrasi uji (10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, dan 55
mg/ml). Pada penelitian ini digunakan antibiotik kloramfenikol sebagai kontrol positif dan pelarut DMSO 30% sebagai kontrol negatif. Banyaknya pengulangan dalam penelitian didasari oleh aturan rumus Gomez (1995), yaitu: (t) (r 1) 20, dimana (t) adalah banyaknya perlakuan dan (r) adalah banyaknya pengulangan yang dapat digunakan dalam penelitian eksperimental. Berdasarkan rumus di atas, jika banyaknya perlakuan (t)=8, maka banyaknya pengulangan adalah 8 (r 1) 20 8r 8 20 8r 28 r 28 8 r 3,5 atau r 4 Dari perhitungan tersebut, maka penelitian dapat dilakukan dengan pengulangan sebanyak lebih dari 3,5 atau dibulatkan menjadi empat kali. Namun, peneliti mengambil pengulangan sebanyak lima kali dengan harapan agar data lebih akurat. C. Populasi dan Sampel Penelitian Populasi pada penelitian ini ialah tanaman patikan kebo (Euphorbia hirta) yang tumbuh di sekitar kampus UPI, Bandung Utara. Adapun sampel yang digunakan ialah tanaman patikan kebo (Euphorbia hirta) yang diujikan pada bakteri Staphylococcus epidermidis.
D. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari hingga Juli 2008. Tempat yang digunakan selama penelitian ialah Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Fisiologi, Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FPMIPA) Universitas Pendidikan Indonesia (UPI). E. Alat dan Bahan Penelitian Peralatan yang digunakan dalam penelitian adalah alat-alat untuk keperluan sterilisasi, ekstraksi bahan, pengkulturan bakteri uji dan pengujian aktivitas zat antibakteri, seperti yang tercantum pada tabel 3.1 dibawah ini. Tabel 3.1 Daftar Alat Penelitian No. Nama Alat Spesifikasi Jumlah 1 Beker glass 100 ml 2 buah 2 Gelas ukur 10 ml, 50 ml, 250 ml 1 buah 3 Waterbath shaker incubator EYELA NTS-1300 1 buah 4 Pinset 4 buah 5 Lemari inkubator Gallenkamp 1 buah 6 Autoklaf HL36AE 1 buah 7 Penggaris Milimeter 1 buah 8 Tabung reaksi 13 x 150 mm 26 buah 9 Labu erlenmeyer 50, 250, 500 dan 1000 ml 4 buah 10 Spidol permanen 1 buah 11 Pipet 3 buah 12 Cawan Petri Diameter 9 cm 30 buah 13 Blender National 1 buah 14 Micropipette SOCOEX CALIBRA 822 1 buah
15 Timbangan analitik HF-300 1 buah 16 Box transfer 1 buah 17 Kawat ose 1 buah 18 Api spirtus 1 buah 19 Vortex mixer SIBATA TTM-1 1 buah 20 Hot plate RCH-3 1 buah 21 Camera digital OLYMPUS 1 buah 22 Colony counter SIBATA 1 buah 23 Rotary evaporator EYELA N-N Serieus 1 buah 24 Gunting 1 buah 25 Gelas arloji 2 buah 26 Lemari es 1 buah 27 ph meter UCHIDA KT-1A 1 buah 28 Spectrophotometer MILTON ROY 1 buah Spectronic 20D 29 Tabung kuvet 2 buah 30 Water destilator EYELA STILL ACE SA-2100 EI 1 buah Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian adalah seperti yang tercantum pada table 2 di bawah ini. Tabel 3.2 Daftar Bahan Penelitian No. Nama Bahan Jumlah 1 Medium NA (Nutrient Agar) 1,5 liter 2 Medium NB (Nutrient Broth) 1 liter 3 Biakan murni bakteri S. epidermidis (ATCC 12228) 1 tabung 4 Daun patikan kebo (Euphorbia hirta) 100 gram 5 Etanol 95% 2 liter
6 Dimethylsulfoxide (DMSO) 50 ml 7 Akuades 5 liter 8 Kloramfenikol 1 kapsul (250 mg) 9 Kertas saring Whatman No.1 4 lembar 10 Cakram kertas secukupnya 11 Kapas 1 bungkus 12 Benang kasur 1 gulung 13 Korek api 1 buah 14 Plastik tahan panas 1 bungkus 15 Kertas label 1 pak 16 NaCl 0,85% 1 liter 17 Air deion 500 ml 18 Alumunium foil 1 gulung 19 Karet 1 bungkus 20 Kain kassa 1 bungkus F. Prosedur Kerja Langkah penelitian ini dibagi menjadi tiga tahap, yaitu tahap persiapan, tahap pengujian, dan tahap pengolahan data. 1. Tahap Persiapan a. Sterilisasi Alat dan Bahan Dilakukan pengumpulan alat-alat yang akan digunakan kemudian dilakukan pembuatan media NA (Nutrient Agar) dan NB (Nutrient Broth). Setelah itu, semua alat dan bahan tersebut disterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit dengan mengatur tekanan sebesar 1,5 kg/cm 2 (1 atm) dan suhu sebesar
121 o C yang sebelumnya telah dibungkus dengan plastik tahan panas. Alat-alat yang tidak tahan panas disterilisasi dengan cara disemprotkan etanol 70%. b. Pembuatan Kurva Tumbuh Bakteri Staphylococcus epidermidis Pada langkah ini diambil satu ose bakteri Staphylococcus epidermidis yang dibiakan dalam medium NA (Gambar 3.1), lalu diinokulasikan pada labu erlenmeyer yang berisi 10 ml media Nutrient Broth (NB) dan diinkubasikan secara aerob pada waterbath shaker incubator bersuhu 37 o C selama 24 jam. Setelah itu, suspensi bakteri tersebut dicampurkan ke dalam 90 ml media NB pada labu erlenmeyer yang lebih besar dan dihomogenkan selama 5 menit. Kemudian, disiapkan medium NB sebagai blanko dan dimasukkan sebanyak 5 ml ke dalam tabung kuvet untuk dilakukan pengaturan besarnya nilai transmitansi hingga sebesar 100% pada alat spectrophotometer dengan panjang gelombang 570 nm. Setelah itu, pada kuvet lainnya dimasukkan 5 ml suspensi bakteri uji yang telah diaktivasi dan dilakukan pula pengukuran nilai kekeruhannya. Suspensi bakteri yang tersisa tetap diinkubasikan secara aerob dan setiap dua jam sekali dilakukan pengukuran kekeruhan seperti sebelumnya. Pengukuran ini dilakukan hingga jam ke-16 usia bakteri. Dari nilai absorbansi yang diperoleh pada setiap usia pertumbuhannya, maka dapat dibuat sebuah kurva tumbuh yang menunjukkan hubungan antara besarnya nilai absorbansi dengan usia bakteri tersebut. Kurva tumbuh tersebut dibuat dengan menggunakan program Microsoft Excel untuk mengetahui fasefase pertumbuhan bakteri uji, sehingga diketahui usia bakteri yang berada pada
fase pertumbuhan logaritmik. Bakteri S. epidermidis yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ialah bakteri yang memiliki laju pertumbuhan tertinggi (Cappuccino & Sherman, 1987: 117). Gambar 3.1 Kultur Murni Bakteri Staphylococcus epidermidis dalam Medium NA berusia 1 hari (Sumber: Koleksi Pribadi) c. Pembuatan Kurva Baku Bakteri Staphylococcus epidermidis Pembuatan kurva baku bakteri dilakukan dengan menghitung jumlah bakteri secara kuantitatif dengan metode cawan tuang (pour plate) yang dihubungkan dengan besarnya nilai absorbansi yang didapat. Langkah ini dilakukan saat usia bakteri berada pada fase logaritmik yaitu pada jam ke-4, 6 dan 8. Satu ose bakteri S. epidermidis diinokulasikan pada labu erlenmeyer yang berisi 10 ml media Nutrient Broth (NB), lalu diinkubasikan secara aerob pada waterbath shaker incubator bersuhu 37 o C selama 24 jam. Setelah itu, suspensi bakteri tersebut dicampurkan ke dalam 90 ml media NB pada labu erlenmeyer dan diaktivasi kembali hingga bakteri berusia pada fase logaritmik. Setelah aktivasi selesai, dilakukan pengukuran besarnya nilai absorbansi pada spectrophotometer untuk tiap usia fase logaritmik tersebut dan disiapkan larutan
NaCl 0,85% untuk dibuat pengenceran suspensi bakteri mulai dari pengenceran 10-1 hingga 10-10. Pengenceran 10-1 dibuat dengan cara mengambil 1 ml suspensi bakteri uji yang telah diaktivasi dan dimasukkan pada tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan NaCl 0,85%, lalu dihomogenkan dengan vortex. Kemudian pada pengenceran 10-2, diambil 1 ml suspensi bakteri pada tabung pengenceran 10-1 tadi dan dicampurkan dengan 9 ml larutan NaCl 0,85% pada tabung lain, begitupun pada pengenceran 10-3 sampai 10-10. Setelah pengenceran bakteri dibuat, pada pengenceran 10-6 hingga 10-10 diambil 1 ml suspensi bakteri dan dicampurkan dengan 9 ml medium Nutrient Agar (NA) cair kemudian dihomogenkan pada cawan Petri. Pada metode cawan tuang ini dilakukan replikasi dua kali (duplo) untuk tiap pengenceran bakteri. Medium yang telah terisi bakteri tersebut dibiarkan beberapa lama hingga memadat dan diinkubasikan secara aerob selama 24 jam pada suhu 37 o C. Keesokan harinya dilakukan penghitungan jumlah koloni bakteri uji yang tumbuh pada medium tersebut dengan menggunakan colony counter. Perkiraan jumlah bakteri sebenarnya dapat diketahui dengan cara mengalikan jumlah koloni yang terhitung dengan besarnya pengenceran. Data jumlah bakteri yang terhitung pada usia logaritmik tersebut dihubungkan dengan nilai absorbansi yang telah diukur sebelumnya, sehingga dapat dibuat sebuah kurva baku yang diperoleh dari hasil analisis program Microsoft Excel. Konsentrasi bakteri uji yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri diatur hingga berkonsentrasi 10 8 cfu/ml (Cappuccino & Sherman, 1987: 75).
d. Identifikasi Tanaman Patikan Kebo (Euphorbia hirta) Determinasi tanaman patikan kebo (Euphorbia hirta) dilakukan dengan menggunakan acuan kunci determinasi Flora of Java (Backer & Brink, 1965) untuk mengetahui ciri-ciri tanaman tersebut yang akan dipilih sebagai sampel penelitian. e. Ekstraksi Daun Patikan Kebo Daun patikan kebo (Euphorbia hirta) yang diambil dari sekitar kampus UPI, Bandung Utara dicuci dengan air bersih lalu dikering-anginkan (tidak terkena sinar matahari langsung) selama satu minggu sampai daun kering. Daun yang telah kering dihaluskan hingga berbentuk serbuk dengan menggunakan blender dan dikumpulkan hingga sebanyak 20 gram. Daun kering dan serbuk daun patikan kebo dapat dilihat pada Gambar 3.2. Serbuk daun tersebut dicampurkan dengan pelarut etanol 95% sebanyak 250 ml dan disimpan pada labu erlenmeyer. Labu tersebut ditutup dan dikocok setiap 30 menit sekali selama 6 jam lalu larutan tersebut dibiarkan (dimaserasi) selama 48 jam. Setelah itu, larutan disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman No.1. Kemudian, hasil saringan tersebut diuapkan pelarutnya dengan menggunakan rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kasar etanol. Serbuk daun yang masih terlihat hijau setelah penyaringan dilarutkan kembali dengan etanol 95% sebanyak 200 ml dan dimaserasi kembali selama 48 jam. Larutan tersebut disaring dengan kertas saring whatman dan diekstraksi pula dengan rotary evaporator. Ekstrak yang diperoleh kemudian dikumpulkan dan dihitung berat
totalnya. Ekstrak diasumsikan telah berkonsentrasi 100% dan siap diencerkan menjadi berbagai konsentrasi dengan menggunakan pelarut DMSO (Dimethylsulfoxide) 30%. Selanjutnya, ekstrak disimpan dalam botol gelap atau botol bening yang ditutup alumunium foil pada suhu 5 o C untuk mencegah terjadinya perubahan kimiawi (Ogbulie et al., 2007: 1545). Gambar 3.2 Daun Kering dan Serbuk Daun Patikan Kebo (Sumber: Koleksi Pribadi) f. Penyediaan Suspensi Bakteri Staphylococcus epidermidis Biakan murni bakteri uji yang telah diperbanyak sebelumnya pada media NA kemudian digunakan untuk pembuatan suspensi bakteri yang jumlahnya diatur hingga 10 8 cfu/ml. Langkah ini dilakukan dengan cara menginokulasikan satu ose bakteri ke dalam 10 ml mediun NB dan diaktivasi selama 24 jam pada waterbath shaker dengan kecepatan 150 rpm. Setelah itu, 10 ml suspensi bakteri tersebut dimasukkan ke dalam 90 ml medium NB yang baru kemudian diaktivasi kembali sampai bakteri berusia fase logaritmik (jam ke-4). Besarnya turbiditas suspensi bakteri diatur hingga mencapai jumlah yang diinginkan (10 8 cfu/ml).
Setelah diperoleh turbiditas suspensi bakteri yang diinginkan, maka suspensi bakteri tersebut siap untuk diujikan. g. Pengenceran Ekstrak Daun Patikan Kebo Pada uji aktivitas antibakteri tahap awal, ekstrak kasar patikan kebo diencerkan dengan pelarut DMSO 30% menjadi berbagai konsentrasi mulai dari 50, 100, 150, 200, 250 hingga 300 mg/ml (Ogbulie et al., 2007: 1544). Kemudian, sebagai uji lanjutan untuk penentuan nilai Konsentrasi Hambat Minimum (KHM), dilakukan pula pengenceran ekstrak hingga berkonsentrasi 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, dan 55 mg/ml. Pada metode ini digunakan pelarut DMSO 30% sebagai kontrol negatif dan antibiotik kloramfenikol 30 g/ml sebagai kontrol positifnya. Sebelum digunakan untuk uji aktivitas antibakteri, ekstrak disimpan dalam botol gelap pada suhu 5 o C untuk menghindari terjadinya perubahan kimiawi. 2. Tahap Pengujian Pelaksanaan uji aktivitas antibakteri dilakukan secara aseptik dengan metoda difusi agar. Cawan Petri diisi dengan medium NA yang telah dicairkan sebelumnya sebanyak 9 ml dan dimasukkan 1 ml inokulum berkonsentrasi 10 8 cfu/ml. Kemudian, cawan digoyang perlahan agar bakteri tersebar merata dan dibiarkan beberapa saat hingga medium memadat. Setelah itu, dilakukan perendaman cakram kertas selama 2 menit pada larutan ekstrak daun patikan kebo untuk berbagai konsentrasi yang telah disiapkan. Cakram kertas tersebut diambil dengan pinset dan dibiarkan beberapa saat agar tidak terlalu basah, kemudian
diletakkan di atas media padat berisi bakteri tadi yang telah diberi label sebelumnya. Satu cawan petri diisi oleh 5 buah cakram kertas untuk pengujian awal dan diisi 7 buah cakram kertas untuk uji lanjutan (penentuan nilai KHM). Pada setiap konsentrasi uji dilakukan replikasi sebanyak lima kali. Media diinkubasikan secara aerob dalam inkubator pada suhu 37 o C selama 24 jam, lalu diukur diameter zona hambat yang terbentuk dengan menggunakan penggaris ukuran milimeter. 3. Tahap Pengolahan Data Data hasil penelitian yang normal dan homogen (setelah diuji dengan uji Kolmogorov-Smirnov dan uji Levene s) akan dianalisa dengan Analysis of Varians (ANOVA) Satu Arah dengan taraf kepercayaan 95% untuk mengetahui ada tidaknya pengaruh yang signifikan pemberian ekstrak daun patikan kebo terhadap pertumbuhan bakteri S. epidermidis, kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey untuk mengetahui perbedaan secara signifikan dari data satu kelompok perlakuan ekstrak dengan kelompok lainnya. G. Alur Penelitian Alur penelitian dapat dilihat seperti pada Gambar 3.3 di bawah ini. Pembuatan proposal penelitian Penyiapan sampel penelitian (daun patikan kebo dan bakteri Staphylococcus epidermidis)
Persiapan alat dan pembuatan medium Sterilisasi alat dan bahan (kecuali daun patikan kebo) Pengkulturan bakteri uji pada media agar miring (NA) Identifikasi tanaman dan ekstraksi daun patikan kebo Pembuatan kurva tumbuh dan kurva baku bakteri uji Pengenceran ekstrak Penyiapan suspensi bakteri uji Uji aktivitas antibakteri Pengukuran diameter daya hambat Pengumpulan dan analisis data Penentuan nilai KHM dan penarikan kesimpulan Penyusunan laporan/skripsi Gambar 3.3 Diagram Alur Penelitian