23 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian berlangsung selama 7 bulan, yaitu penelitian in vitro bulan Januari sampai Maret 2009 di Laboratorium Biokimia Institut Pertanian Bogor (IPB) dan penelitian in vivo bulan Mei sampai Agustus 2009 bertempat di Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong. 1. Penelitian in vitro Alat dan Bahan Alat-alat : autoklaf, oven, wisebath, shaker, rotavapor, spektrofotometer UV, laminar air flow cabinet, cawan petri, jarum ose, beberapa alat gelas, jangka sorong, mikropipet, inkubator, sarung tangan karet, neraca analitik, kain kasa, kertas saring dan vacuum dryer. Bahan utama : raw propolis yaitu sarang lebah yang telah diambil madunya dari peternakan lebah Trigona spp asal Pandeglang Banten. Bahan penunjang : bakteri Escherichia coli, cairan rumen sapi, maltodektsrin, magnesium stearat, propolis X dan ampisilin 227 mg. Media : NA (Nutrient Agar) dan NB (Nutrient Broth), TSA (Trypton Soy Agar) dan TSB (Trypton Soy Broth), EMB (Eosyn Methylene Blue). Pelarut : etanol 70%, propilen glikol, akuades. Metode Penelitian Ekstraksi Propolis Ekstraksi dilakukan secara maserasi dengan pelarut etanol 70%. Sebanyak kurang lebih 200 gram propolis yang diperoleh dari 30 buah sarang lebah Trigona spp. direndam dengan 650 ml etanol 70%, ditutup lalu disimpan di ruang gelap dan dikocok dengan shaker 120 rpm selama satu minggu. Setelah itu, filtrat
24 diambil dan residu dimaserasi kembali dengan 50 ml etanol. Selanjutnya filtrat diambil setiap hari selama satu minggu. Setelah tujuh hari, atau setelah dihasilkan warna jernih, maserasi diakhiri. Setelah filtrat ekstrak propolis diperoleh, dilakukan pemekatan dengan menggunakan rotavapor pada suhu ± 40 C. Ekstrak pekat ini ditimbang untuk mendapatkan nilai rendemennya. Pengambilan Cairan Rumen Sapi Cairan rumen sapi segar diambil di Rumah Potong Hewan (RPH) terpadu Tanah Sareal, Bogor jam 03.00-05.00 WIB. Suhu dan nilai ph rumen diukur di tempat. Pengambilan cairan rumen dilakukan secara aerobik menggunakan kain kasa. Cairan rumen ditempatkan di wadah bersih. Cairan rumen yang diambil sekitar 1.5-2 L. Mikrokapsulasi Propolis Mikrokapsulasi propolis dilakukan dengan membuat dua konsentrasi mikrokapsul propolis, yaitu 2% dan 4%. Formulasi yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 3. Diagram alir mikrokapsulasi propolis dapat dilihat pada Lampiran 4. Pembuatan mikrokapsul 2% dilakukan dengan mencampurkan 93 gram maltodekstrin dengan akuades dengan perbandingan 1: 1 (campuran A). Selanjutnya sebanyak dua gram ekstrak pekat propolis dicampurkan dengan propilen glikol dengan perbandingan 1:1 (campuran B). Kemudian, kedua campuran A dan B dicampurkan sampai larut. Setelah larut, campuran tersebut dikeringkan melalui proses vacuum drying selama tiga jam dengan suhu 40-50 C dan kecepatan pengadukan 120 rpm. Regenerasi Bakteri Escherichia coli. Bakteri E. coli dari kultur primer mula-mula dibiakkan ke dalam TSA slant 4%. Sebanyak satu ose bakteri digoreskan ke dalam TSA slant lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Selanjutnya, biakan ini menjadi stok awal bakteri yang disimpan pada suhu 4-5ºC. Bakteri E. coli yang akan
25 digunakan pada uji aktivitas, diinokulasikan kembali pada TSB 4% sebanyak dua ose lalu diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam. Uji Mikrokapsul Propolis Trigona spp. dalam Cairan Rumen Sapi Bentuk sediaan mikrokapsul propolis 2% dan 4% masing-masing sebanyak 227 mg direaksikan dengan cairan rumen sapi. Langkah pertama, mikrokapsul propolis dimasukkan ke dalam botol 75 ml yang telah disi dengan cairan rumen sapi sebanyak 50 ml. Tahap kedua, semua botol yang telah diisikan mikrokapsul propolis kemudian digojog dengan shaker dan dikondisikan pada suhu 37ºC dan 120 rpm. Tahap terakhir adalah pengamatan terhadap residu mikrokapsul propolis dalam cairan rumen tiap 3 jam sekali, yaitu 0, 3, 6, 9, 12, dan 24 jam. Uji Aktivitas Antibakteri Mikrokapsul Propolis setelah Dipapar Cairan Rumen Sapi Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi sumur dengan tujuan mengetahui aktivitas antibakteri propolis dengan terbentuknya zona bening. Larutan uji yang digunakan merupakan cairan rumen yang dipapar oleh cairan rumen sapi. Kontrol positif yang dipakai adalah ampisilin 227 mg, sedangkan kontrol negatif yang dipakai adalah akuades. Sebagai pembanding digunakan propolis X. Kontrol pelarut yang dipakai adalah etanol 70% dan propilen glikol. Mikrokapsul propolis Trigona spp yang telah dipapar dalam cairan rumen kemudian diuji aktivitasnya terhadap bakteri Escherichia coli. Masing-masing perlakuan (konsentrasi 2% dan 4%) diambil sebanyak 50 µl untuk dimasukkan ke dalam lubang yang telah disipkan dari media eosin methylene blue (EMB) yang sudah diinokulasi dengan bakteri E. coli. Diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Aktivitas antibakteri diperoleh dengan mengukur zona bening 2. Pengujian mikrokapsul propolis secara in vivo Alat dan Bahan Alat-alat : Timbangan sapi, timbangan rumput, sekop, bak karet Bahan utama : sapi (PO)
26 Ternak Ternak yang digunakan adalah sapi Peranakan Ongole (PO) dengan jenis kelamin jantan sebanyak 16 ekor diperoleh dari Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong. Sapi dipilih yang berumur antara 1-1,5 tahun dengan bobot badan awal rata-rata 200 kg. Kondisi sapi sehat dan mempunyai aktivitas normal. Sapi-sapi ini dikandangkan secara individu yang dilengkapi tempat pakan dan minum. Pemberian pakan Sapi diberi pakan basal rumput lapangan cacah mengandung protein10.76%, abu 8.30%, Neutral Detergent Fibre (NDF) 67.4% dan Acid Detergent Fibre (ADF) 62.11%. Rumput lapang diberikan ad libitum sedangkan konsentrat diberikan 1% dari bobot hidup. Komposisi kimiawi pakan disajikan pada Tabel 1. Konsentrat diberikan satu kali sehari, setelah habis dilanjutkan pemberian rumput. Rumput diberikan 2 kali sehari yaitu pukul 07.00 dan pukul 14.00 WIB. Air tersedia tanpa batas. Propolis diberikan pada pagi hari seminggu sekali, selama tiga bulan dengan mencampurkan dalam 0.5 kg pakan (konsentrat), untuk memastikan bahwa seluruh propolis terkonsumsi. Sisa jatah konsentrat (tanpa propolis) kemudian diberikan semuanya. Tabel 2. Komposisi kimiawi pakan sapi PO Bahan Pakan BK Kandungan nutrisi dalam 100% BK Abu Protein NDF ADF (%) Rumput lapangan 88.69 9.36 12.13 76.00 70.04 Konsentrat 81.7 19.31 14.42 67.35 33.15 Keterangan : BK: bahan kering, NDF: Neutral Detergent Fibre, ADF: Acid Detergent Fibre Rancangan percobaan Penelitian terbagi dua periode, yaitu periode pendahuluan terdiri atas 10 hari pengenalan dengan kandang baru dengan diberi pakan rumput dan satu minggu pengenalan perlakuan, dilanjutkan periode pengumpulan data selama 3
27 bulan. Pada pertengahan periode penelitian dilakukan uji kecernaan pakan selama 6 hari. Sapi yang digunakan dalam percobaan dibagi dalam empat kelompok. Kelompok I diberi mikrokapsul propolis 2% dengan dosis 227 mg/kg yang dicampur dalam 0.5 kg konsentrat, kelompok II diberi mikrokapsul propolis 4% dengan dosis 227 mg/kg yang dicampur dalam 0.5 kg konsentrat dan kelompok III diberi raw propolis sebanyak 22.72 g/ekor yang dicampur dalam 0.5 kg konsentrat dan kelompok IV digunakan sebagai kontrol normal. Pemberian raw propolis sebanyak 22.72 g/ekor berdasarkan rendemen propolis yang diperoleh yaitu 8% dari 200 gr raw propolis. Peubah yang diamati 1. Konsumsi Pakan Konsumsi pakan didapatkan dengan menghitung jumlah pakan yang diberikan dengan jumlah pakan yang tersisa untuk tiap ekor. Konsumsi dihitung dalam satuan bahan pakan segar dan bahan kering. 2. Kecernaan Bahan Kering dan Bahan Organik Koleksi feses dan pakan sisa (rumput) dilakukan setiap hari selama enam hari. Sampel feses dan pakan sisa diambil sebanyak 5%, kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari. Sampel feses, pakan dan sisa digiling, kemudian dilakukan analisis terhadap bahan kering, abu, protein, NDF dan ADF. Analisis bahan kering dan bahan organik dilakukan dengan menimbang bobot cawan kosong yang telah dikeringkan pada oven 105 C. Lalu cawan berisi sampel dimasukkan dalam oven 105 C selama 6 jam, pada saat dikeluarkan cawan segera dimasukkan dalam eksikator selama 15 menit dan ditimbang. Untuk perhitungan abu, sampel dalam cawan yang telah ditimbang lalu dimasukkan kedalam tanur dan diabukan pada suhu 600 C selama 6 jam. Setelah pendinginan dalam tanur, cawan dimasukkan kedalam eksikator selama 30 menit dan ditimbang. Bahan organik merupakan bahan kering yang hilang setelah sampel dipanaskan dalam tanur tinggi.
28 3. Pertambahan Bobot Badan Setiap dua minggu sekali dilakukan penimbangan bobot badan sapi pada pagi hari sebelum ternak diberi pakan. Pertambahan bobot badan dihitung dengan mengurangi bobot badan sapi akhir pemeliharaan dengan bobot badan awal. 4. Konversi Pakan Perhitungan konversi pakan didapatkan dengan konsumsi pakan bahan kering sapi dibagi dengan jumlah pertambahan bobot badan sapi Analisis Statistik Rancangan yang digunakan dalam percobaan adalah rancangan percobaan acak lengkap satu faktor. Model rancangannya sebagai berikut (Mattjik & Sumertajaya 2002). Y ij = µ + τi + ij Yij = Pengamatan perlakuan ke-i, dan ulangan ke-k = Rataan umum τi = pengaruh perlakuan ke-i ij = Galat perlakuan i = 1,2,...5 dan j = 1,2,...5 Rancangan percobaan ini digunakan pada pengukuran zona bening ekstrak propolis terhadap bakteri Escherichia coli (in vitro), Konsumsi pakan, Kapasitas pakan, Kecernaan pakan, Pertambahan bobot badan sapi dan Konversi pakan (in vivo). Data yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA (Analysis of variance) pada selang kepercayaan 95% dan taraf 0.05. Uji Duncan dilakukan jika hasil penelitian berbeda nyata. Data in vitro dianalisis dengan menggunakan SAS 9.1 dan in vivo dianalisis dengan menggunakan program SPSS 15.