BAB 3 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Juli 2011 sampai dengan bulan Maret 2012. Kegiatan ini dilakukan di laboratorium Bagian Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelas objek, kaca penutup, mikroskop, cawan petri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, ose, spiritus, ruang inokulasi, inkubator, lemari es, otoklaf, oven, termos es, pinset, dan pipet. Bahan yang digunakan antara lain contoh susu, contoh air yang digunakan sebagai sumber air di peternakan, pelicin (vaselin, mentega) yang digunakan saat pemerahan, usapan tangan pemerah, usapan lendir vagina sapi, urin yang baru keluar, Potato Dextrose Broth (PDB) sebagai media transport, Lactophenol Cotton Blue (LPCB), Pottato Dextrose Agar (PDA), NaCl, air suling sucihama, putih telur bebek, Sugar Assimilation Medium, antibiotika (kloramfenikol) dan anticendawan (ketokonazol, flukonazol, itrakonazol, griseofulvin). Rancangan Penelitian Pengambilan Contoh Pengambilan contoh dilakukan di beberapa lokasi peternakan sapi perah yaitu Cipanas (Bapak Suroso), Cisarua (Bapak H. Karom), Kebon Pedes (Bapak Syarib Hidayat), dan Kawasan Usaha Peternakan (KUNAK), Cibungbulang (Bapak Cecep). Contoh yang diambil berupa susu yang baru diperah, sumber air yang digunakan di peternakan, pelicin yang digunakan saat pemerahan, usapan tangan pemerah, usapan vagina sapi, dan urin yang baru keluar.
17 Perlakuan Contoh Contoh diproses di ruang inokulasi. Pembiakan masing-masing contoh dilakukan dengan metode agar tuang. Tahapan-tahapan dari proses pembiakan contoh ini adalah : (a) Sebanyak satu mililiter contoh diambil kemudian dicampurkan ke dalam tabung yang telah berisi sembilan mililiter air suling sucihama sehingga diperoleh tingkat pengenceran 1/10. Suspensi ini dihomogenkan dan diambil sebanyak satu mililiter ke dalam cawan petri suci hama. Selanjutnya, untuk mendapatkan suspensi dengan tingkat pengenceran 1/100, dilakukan dengan mengambil suspensi pada tabung pertama sebanyak satu mililiter dan dicampurkan ke dalam tabung kedua yang telah berisi sembilan mililiter air suling sucihama. Suspensi kedua ini dihomogenkan kembali dan dimasukkan sebanyak satu mililiter ke dalam cawan petri suci hama. (b) Media PDA yang siap membeku dituangkan ke dalam cawan yang berisi suspensi contoh. Cawan digoyang goyangkan mengikuti angka delapan agar suspensi dan media tercampur sempurna. Media didiamkan untuk memadat dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 3 hari. Pengamatan terhadap Koloni yang Tumbuh pada Media PDA Pengamatan dilakukan terhadap koloni yang tumbuh pada pembiakan setelah masa inkubasi dicapai. Pengamatan yang dilakukan meliputi warna, bentuk, dan bau koloni. Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan pewarnaan Lactophenol Cotton Blue atau lugol mengenai ukuran dan bentuk sel, ada tidaknya miselium, kapsul dan budding cell, dan ciri ciri morfologi yang lain dilakukan terhadap koloni yang diduga sebagai koloni Candida berdasarkan pengamatan makroskopik. Koloni yang diduga adalah koloni Candida berdasarkan pengamatan makroskopik dan mikroskopik disubkultur ke media agar miring PDA dan diinkubasi pada suhu 25-27 o C selama 3 hari.
18 Identifikasi Isolat Pemeriksaan dilanjutkan dengan melakukan serangkaian pemeriksaan untuk identifikasi spesies dari Candida. Identifikasi ini dilakukan dengan metode yang telah dilakukan oleh Marinho et al. (2010). (a) Uji tabung kecambah (tabung kecambah test) Media yang digunakan adalah bahan yang mengandung faktor protein, seperti putih telur, serum dan plasma. Pada penelitian ini media yang digunakan adalah putih telur bebek. Biakan murni berumur 24 jam dibiakkan ke dalam 0,5 ml putih telur bebek dan kemudian diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 2 jam. Setelah 2 jam, biakan diperiksa di bawah mikroskop untuk mengetahui ada tidaknya tabung kecambah seperti yang terpapar pada Gambar 9 di bawah ini. Gambar 9 Uji tabung kecambah (Saigal et al. 2011) (b) Uji asimilasi gula-gula - Deretan tabung reaksi berisi media cair Sugar assimilation medium yang mengandung gula-gula yang diperlukan yaitu glukosa, maltosa, sukrosa, laktosa, arabinosa, dan manitol. Satu tabung kontrol yang berisi media yang sama tetapi tidak mengandung gula disiapkan untuk keperluan uji ini. - Secara aseptik, sedikit koloni khamir (paling lama berumur 3 hari) dipindahkan ke tabung reaksi yang di dalamnya telah terdapat dua mililiter air suling sucihama. Suspensi tersebut dihomogenkan dan kekeruhannya disamakan dengan larutan McFarland #1. - Secara aseptik, sebanyak 0,2 ml suspensi khamir yang telah homogen dipindahkan ke tabung-tabung gula-gula dan juga ke tabung kontrol. Seluruh
19 tabung yang mendapatkan isolat diinkubasi pada suhu 30 o C selama tujuh hari atau setelah terjadi perubahan warna (keruh). - Hasil positif ditandai dengan adanya pertumbuhan dan terlihat media di tabung menjadi keruh dibandingkan media di tabung kontrol. Uji Aktivitas Anticendawan Uji ini dilakukan hanya untuk koloni yang sudah dipastikan sebagai koloni C. albicans. Pengujian aktivitas anticendawan ini bertujuan untuk melihat apakah khamir masih peka terhadap anticendawan yang diberikan dengan melihat terbentuk tidaknya zona hambat. Pengujian ini menggunakan metode difusi agar dan metode ini dilakukan berdasarkan metode yang digunakan oleh Rostinawati et al. (2009). Anticendawan yang digunakan adalah ketokonazol, flukonazol, itrakonazol dan griseofulvin dengan berbagai kadar pengenceran (sampai terbentuk adanya zona hambat). Suspensi C. albicans dibuat dengan mengambil biakan menggunakan ose lalu diencerkan dengan NaCl 0,9% suci hama dan disesuaikan kepekatannya dengan larutan McFarland #1. Sebanyak 0,1 ml suspensi diteteskan ke atas permukaan media PDA di cawan petri. Tetesan disapu-ratakan dengan menggunakan kapas bergagang (cotton swab) sucihama dengan harapan seluruh permukaan lempengan agar. Setelah didiamkan selama lima menit, agar dilubangi sebanyak lima lubang dengan jarak yang telah diatur sedemikian rupa sehingga tidak terjadi penumpukan zona hambat yang akan dihasilkan nantinya. Sebanyak 50 µl masing-masing suspensi anticendawan yang digunakan ke dalam lubanglubang yang telah dibuat. Cawan yang telah selesai diberi perlakuan diinkubasi pada suhu 27-29 ºC selama 24-48 jam. Adanya aktivitas anticendawan akan ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambat di sekitar lubang. Pencarian Kadar Hambat Minimum (Minimum Inhibition Concentration- MIC) Uji ini diawali dengan menempatkan koloni C. albicans umur 24 jam ke tabung reaksi yang di dalamnya terdapat sembilan mililiter air suling sucihama dan dihomogenkan untuk disamakan kepekatannya dengan larutan McFarland #1 (diperkirakan setara dengan jumlah 10 8 CFU/mL). Suspensi diencerkan sampai
20 kandungan khamir diperkirakan mencapai 10 6 CFU/mL. Sebanyak 11,25 µl anticendawan yang akan diuji ditambahkan ke dalam suspensi pengenceran terakhir (10 6 CFU/mL). Anticendawan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ketokonazol dengan kadar 0,125 µg/ml, 0,5 µg/ml, 2 µg/ml, dan 8 µg/ml; itrakonazol dengan kadar 0.125 µg/ml, 0.5 µg/ml, 4 µg/ml, dan 16 µg/ml; flukonazol dengan kadar 0.25 µg/ml, 2 µg/ml, 8 µg/ml, dan 32 µg/ml; dan griseofulvin dengan kadar 0,25 µg/ml, 4 µg/ml, 8 µg/ml, dan 64 µg/ml. Suspensi C. albicans yang telah ditambahi anticendawan diencerkan sampai ke tingkat pengenceran 10-7. Sebanyak satu mililiter dari masing-masing tabung pengenceran 10-3 sampai 10-7 dituangkan ke dalam satu cawan petri kosong dan sucihama. Proses ini dilakukan secara triplo. Setelah itu, ke dalam semua cawan dituangi media PDA yang diimbuhi kloramfenikol (0,05 mg/ml medium). Cawan digoyang membentuk angka 8 sehingga suspensi tercampur merata memadat. Setelah didiamkan dan agar memadat, seluruh cawan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Koloni yang tumbuh setelah masa inkubasi dicapai dihitung dengan aturan hanya cawan yang diperkirakan mengandung kisaran 25-250 CFU koloni yang tumbuh saja yang akan dihitung. Analisis Data Data kepekaan anticendawan terhadap C. albicans yang dihasilkan pada penelitian ini dianalisis secara deskriptif.