17 3 METODOLOGI 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari-Juni 2011 di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Laboratorium Biokimia Hasil Perairan (Departemen Teknologi Hasil Perairan), Laboratorium Kesehatan Ikan (Departemen Budidaya Perairan), Laboratorium Teknik Pengolahan Pangan (Departemen Teknologi Pangan), dan Laboratorium Histopatologi (Fakultas Kedokteran Hewan), Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan utama berupa ikan bandeng (Chanos chanos) dengan ukuran 200-250 g/ekor. Ikan bandeng yang diamati adalah ikan bandeng yang disimpan pada suhu chilling. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis proksimat meliputi H 2 SO 4 (MERCK p.a.), kjeltab Selenium (MERCK p.a.), NaOH (MERCK p.a.), H 3 BO 3 (MERCK p.a.), n-heksana (MERCK p.a.), dan HCl (MERCK p.a.). Bahan-bahan yang digunakan untuk pembuatan preparat histologi terdiri dari larutan Buffer Normal Formalin 10% (MERCK p.a.), Bouin s 10% (MERCK p.a.), alkohol 50-100% (MERCK p.a.), xylol (MERCK p.a.), parafin (MERCK p.a.), hematoksilin (MERCK), eosin (MERCK), dan mounting agent (MERCK). Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi sokhlet (SIBATA SB 6), tabung kjehdahl (PYREX), tanur pengabuan (Yamato FM 38), timbangan analitik (AND HF 400), oven (Yamato DV 40), cetakan yang terbuat dari kertas kalender, rotary mikrotom (Yamato Kohki LR-85), Mikroskop Cahaya Olympus BX51, Microcular MD 130 Electron Eyepiece serta peralatan uji organoleptik, kamera digital canon A495, dan penetrometer (Precision, Scientific Petroleum Instruments). 3.3 Metode Penelitian Sampel ikan bandeng dimatikan dengan menusuk oblongata setelah itu sebagian ikan diambil dan diuji proksimat. Ikan lainnya disimpan pada suhu chilling (±5 C) selama 23 hari (sampai ikan busuk). Ikan yang disimpan tersebut
18 diamati setiap hari dan dilakukan pengujian tekstur dan pengamatan histologis pada setiap fase kemunduran mutu (pre rigor, rigor, post rigor, dan busuk). Tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 6. Ikan Bandeng Dimatikan Analisis proksimat Penyimpanan pada suhu chilling (± 5 C) selama 23 hari Pre rigor Rigor Post rigor Busuk Analisis tekstur & Histologi Gambar 6 Diagram alir penelitian. 3.3.1 Analisis proksimat (AOAC 1995) Analisis proksimat adalah metode analisis kimia untuk mengidentifikasi kandungan nutrisi pada suatu bahan. Analisis proksimat dilakukan pada daging ikan bandeng, meliputi analisis kadar air, abu, protein, lemak, dan karbohidrat. (1) Kadar air (AOAC 1995) Sejumlah sampel (± 5 g) dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui beratnya. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam oven bersuhu 100 ºC hingga diperoleh berat yang konstan. Perhitungan kadar air dilakukan berdasarkan berat basah dengan menggunakan rumus :
19 Kadar air (% bb) = x 100% Keterangan: a = berat cawan dan sampel awal (g) b = berat cawan dan sampel akhir (g) c = berat sampel awal (g) (2) Kadar lemak (AOAC 1995) Labu lemak yang akan digunakan dikeringkan dalam oven bersuhu 110 ºC, didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sampel ditimbang sebanyak 5 gram, dibungkus dengan kertas saring dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi (soxhlet) yang telah berisi pelarut heksana. Proses reflux dilakukan sampai larutan jernih dan pelarut yang ada di dalam labu lemak terdistilasi. Selanjutnya labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105 ºC hingga beratnya konstan, didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Kadar lemak dihitung dengan rumus: Kadar lemak = x 100% (3) Kadar abu (AOAC 1995) Cawan porselin dikeringkan dalam oven bersuhu 110 ºC, kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sebanyak 5 gram sampel ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan porselin. Selanjutnya sampel dipijarkan di atas nyala pembakar bunsen sampai tidak berasap lagi, kemudian dilakukan pengabuan di dalam tanur listrik pada suhu 400-600 ºC selama 4-6 jam atau sampai terbentuk abu berwarna putih. Kemudian sampel didinginkan dalam desikator, selanjutnya ditimbang. Perhitungan kadar abu dilakukan dengan rumus: Kadar abu = x 100% (4) Kadar protein, metode mikro-kjeldahl (AOAC 1995) Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari destruksi, destilasi dan titrasi.
20 (a) Tahap destruksi Daging ikan bandeng ditimbang sebesar 1 gram kemudian sampel tersebut dimasukkan ke dalam tabung kjehdahl. Sebanyak 0,25 gram selenium dan 25 ml H 2 SO 4 pekat ditambahkan ke dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas. Proses destruksi dilakukan sampai larutan berwarna bening. (b) Tahap destilasi Sampel yang telah didestruksi dituangkan ke dalam labu destilasi lalu ditambahkan akuades 50 ml. Air bilasan juga dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan larutan NaOH 40% sebanyak 20 ml. Cairan dalam ujung tabung kondensor ditampung dalam erlenmeyer 10 ml berisi larutan H 3 BO 3 dan 2 tetes indikator (cairan methyl red dan brom creosol green) yang ada di bawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai diperoleh 10 ml destilat dan berwarna hijau kebiruan. (c) Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1 N sampai warna larutan erlenmeyer berubah menjadi merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Perhitungan kadar protein kulit ikan bandeng ditentukan dengan rumus : (5) Kadar karbohidrat (by difference) (AOAC 1995) Kadar karbohidrat (%) = 100% - (P + KA + A + L) Keterangan: P = kadar protein (%) KA = kadar air (%) A = kadar abu (%) L = kadar lemak (%) 3.3.2 Uji organoleptik (BSN 2006) Metode yang digunakan untuk uji organoleptik atau uji sensori adalah dengan menggunakan score sheet berdasarkan SNI 01-2729.1-2006. Pengujian menggunakan 15 panelis semi terlatih yang memiliki kriteria, antara lain tertarik
21 dan mau berpartisipasi dalam uji organoleptik, terampil, dan konsisten dalam mengambil keputusan, siap sedia pada saat dibutuhkan dalam pengujian, tidak menolak contoh yang akan diuji, berbadan sehat, bebas dari penyakit THT dan tidak buta warna, dan tidak merokok. Berdasarkan data yang diperoleh, kemudian dilakukan analisis kesegaran ikan dengan kriteria sebagai berikut (SNI 01-2729.1-2006): Segar : nilai organoleptik berkisar antara 7-9 Agak segar : nilai organoleptik berkisar antara 5-6 Tidak segar : nilai organoleptik berkisar antara 1-3 3.3.3 Analisis kekerasan (Precision, Scientific Petroleum Instruments) Prinsip pengukuran tekstur bahan pangan dengan penetrometer adalah dengan memberikan gaya tekan kepada bahan dengan besaran tertentu sehingga bahan dapat ditentukan. Ikan bandeng dengan ukuran 200-250 gram dianalisis menggunakan penetrometer. 3.3.4 Pembuatan preparat histologis (Angka et al. 1990) Pembuatan preparat histopatologi terdiri dari tiga tahapan besar yaitu fiksasi jaringan dan parafinisasi, pemotongan jaringan, serta pewarnaan jaringan (Gambar 7). Organ target, misal otot, diambil menggunakan alat bedah yang sesuai. Otot ikan disayat menggunakan pisau scalpel yang tajam agar jaringan otot tidak rusak. Ikan disayat membentuk persegi panjang dengan ketebalan 5 mm agar bahan fiksatif dapat meresap sempurna. Jaringan otot yang diperoleh direndam dalam larutan fiksatif selama 48 jam, perendaman dilakukan sebanyak 15-20 kali volume jaringan dan dilanjutkan dengan dehidrasi. Larutan fiksatif dibuang, kemudian alkohol 70% dimasukkan ke dalam botol film hingga jaringan terendam, selanjutnya organ diambil dari dalam botol film dan dibungkus menggunakan kain kasa lalu diikat menggunakan benang yang dibentuk seperti teh celup, agar memudahkan dalam proses pergantian alkohol setelah 24 jam, organ yang dibungkus kain kasa diambil dan ditiriskan di atas kertas tisu lalu dimasukkan ke dalam botol berisi alkohol 80%, 90%, 95% masing-masing selama
22 dua jam dan alkohol 100% selama 12 jam dengan cara yang sama. Perendaman dilakukan pada suhu ruang (Rumawas et al. 1974). Proses selanjutnya adalah clearing. Jaringan direndam dalam alkohol-xylol (1:1) selama 30 menit, dilanjutkan dengan xylol I, xylol II dan xylol III masingmasing selama 30 menit. Perendaman dilakukan pada suhu ruang. Selanjutnya dilakukan tahap impregnasi, yaitu penggantian xylol dengan paraffin cair yang berlangsung di dalam oven dengan suhu 60 C. Proses ini dilakukan dengan perendaman jaringan ke dalam xylol-parafin (1:1) yang diletakkan dalam gelas piala selama 45 menit. Proses perendaman dilakukan dengan cara yang sama seperti proses perendaman sebelumnya kemudian dilanjutkan dengan embedding yang merupakan proses memasukkan parafin cair ke dalam sel. Proses ini berlangsung di dalam oven dengan suhu 60 C. Jaringan direndam secara berturutturut ke dalam gelas piala yang berisi parafin I, parafin II dan parafin III masingmasing selama 45 menit. Proses perendaman dilakukan dengan cara sama, seperti proses perendaman sebelumnya. Jaringan yang telah diembedding dalam parafin cair lalu diblok (dicetak agar mudah dipotong) dengan parafin cair, kemudian dibekukan. Proses ini membutuhkan cetakan yang dapat dibuat dari kertas kaku, seperti kertas kalender dengan ukuran 2x2x2 cm. Parafin cair dituangkan ke dalam cetakan hingga memenuhi 1/8 bagian cetakan dan dibiarkan hingga sedikit membeku. Proses selanjutnya, jaringan disusun dalam cetakan dengan bagian sayatan yang diperlukan menghadap dasar cetakan dan dituangi parafin cair hingga material jaringan terendam selanjutnya dibiarkan beku dalam suhu ruang selama 24 jam setelah parafin beku dengan sempurna, blok parafin dikeluarkan dari cetakan lalu dipotong tipis menggunakan silet bermata satu agar dapat disesuaikan dengan tempat blok pada alat pemotong. Pemotongan jaringan dimulai dengan meletakkan blok parafin yang mengandung preparat pada tempat duduknya di mikrotom. Tempat duduk blok parafin beserta blok parafinnya kemudian diletakkan pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan kuat. Mata pisau mikrotom harus tajam agar proses pemotongan dapat dilakukan dengan sempurna. Ketebalan potongan diatur dengan cara menggeser bagian pengatur ketebalan hingga ketebalan yang
23 diinginkan. Ketebalan sayatan yaitu 4 µm. Blok preparat digerakkan ke arah pisau sedekat mungkin lalu blok preparat dipotong secara teratur dan ritmis. Pita-pita parafin yang awal tanpa jaringan dibuang hingga diperoleh potongan yang mengandung preparat jaringan. Hasil irisan diambil dengan jarum lalu diletakkan di permukaan air hangat dalam 45-50 C waterbath hingga mengembang setelah pita parafin terkembang dengan baik, pita parafin tersebut ditempelkan pada gelas objek yang telah diberi zat perekat, seperti albumin dengan cara memasukkan kaca objek itu ke dalam waterbath dan menggerakkannya ke arah pita parafin. Setelah melekat, gelas objek digerakkan keluar dari waterbath dengan hati-hati agar pita parafin tidak melipat dan dibiarkan hingga mengering setelah itu dilanjutkan dengan dewaxing yang dimulai dengan meletakkan gelas objek yang berisi jaringan dalam keranjang preparat yang ukurannya sesuai dengan gelas objek. Keranjang tersebut dapat diisi dengan 10 gelas objek. Jaringan pada gelas objek yang telah diletakkan dalam keranjang direndam ke dalam xylol I dan xylol II masing-masing selama 2 menit. Lilin akan terlepas dari jaringan dan jaringan akan tampak jernih selanjutnya dilakukan hidrasi yang merupakan proses pemasukkan air ke dalam preparat jaringan pada gelas objek setelah proses dewaxing. Jaringan pada gelas direndam dalam alkohol 100% dalam wadah perendaman, lalu secara berturut-turut dimasukkan ke dalam alkohol 95%, 90%, 80%, 70% dan 50% masing-masing selama dua menit dengan cara yang sama pula selanjutnya preparat jaringan direndam ke dalam akuades selama dua menit setelah hidrasi preparat jaringan diberi pewarna hematoksilin-eosin. Preparat jaringan direndam dengan pewarna hematoksilin selama 7 menit kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kelebihan zat warna yang tidak diserap, lalu preparat jaringan direndam dengan pewarna eosin selama 3 menit dan dicuci dengan akuades. Preparat jaringan kemudian direndam dalam alkohol 70%, 85%, 90% dan 100% masing-masing dilakukan selama dua menit selanjutnya preparat jaringan lalu direndam dalam xylol I dan xylol II masing-masing selama dua menit.
24 Ikan bandeng daging dan mata Fiksasi larutan Bouin s Dehidrasi alkohol (80%, 90%, 95%, 100%) Penjernihan (clearing) alkohol-xilol (1:1) Impregnasi xilol-parafin (1:1) Penanaman (embedding) dalam parafin Trimming Pemotongan dengan mikrotom ketebalan ± 4 µm Pelekatan pita parafin pada gelas obyek Pewarnaan Hematoksilin-Eosin Perekatan jaringan dengan mounting agent Preparat awetan Pengamatan mikroskop (100x) Pengambilan gambar Gambar 7 Diagram alir proses pembuatan preparat histologi (Angka et al. 1990)
25 Preparat jaringan yang telah diwarnai dapat dibuat preparat yang lebih awet dengan cara mounting menggunakan mounting agent seperti enthelan. Preparat jaringan ditutup dengan gelas penutup yang sudah ditetesi enthelan dan dikeringkan dalam oven pada suhu 40 C selama 24 jam, kemudian diamati di bawah mikroskop. Preparat histologi diamati dengan menggunakan mikroskop dengan perbesaran mulai dari 40x hingga 1000x sesuai dengan kejelasan objek selanjutnya dilakukan dokumentasi menggunakan foto untuk dijadikan bahan analisis deskriptif. 3.3.5 Analisis data secara deskriptif Data dianalisis dengan caradeskripsi kualitatif dengan melihat preparat histologi di bawah mikroskop selanjutnya dari preparat tersebut dianalisis perubahan yang terjadi dari setiap jaringan pada fase-fase pasca kematian (prerigor, rigor, postrigor, busuk) sebagai pendukung dalam analisis juga diikutsertakan hasil pengujian proksimat, organoleptik dan kekerasan.