17 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan di Rumah Kaca, University Farm, Institut Pertanian Bogor pada bulan Oktober 2011 sampai bulan Mei 2012. Penyiapan Tanaman Uji Benih yang digunakan dalam pengujian adalah varietas Arthaloka. Varietas ini dipilih karena banyak digunakan oleh petani. Sebelum dilakukan penyemaian, dipilih terlebih dahulu benih yang sehat dan tidak memiliki cacat secara morfologi. Benih yang telah dipilih kemudian ditanam pada nampan berukuran 25 cm x 35 cm. Pada setiap nampan ditanami 15 sampai 20 benih sehingga dibutuhkan masing-masing 10 nampan untuk uji penekanan kejadian penyakit dan uji pemacuan pertumbuhan. Media tanam yang digunakan dalam persemaian adalah tanah steril dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:1. Persemaian dilakukan selama 3 minggu dengan dilakukan penyiraman sesuai dengan kebutuhan bibit dan dilihat dari tingkat kelembaban tanah. Pemeliharaan dan Penyiapan Suspensi Bakteri Endofit dan PGPR Bakteri endofit dan PGPR yang digunakan dalam penelitian merupakan koleksi Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Fakultas Pertanian, IPB. Bakteri endofit yang digunakan adalah bakteri endofit dengan kode BC4 dan berdasarkan penelitian Damayanti (2010), isolat dengan kode BC4 adalah isolat yang memberikan penekanan yang paling efektif terhadap kejadian penyakit secara in vitro maupun in planta. Hasil identifikasi berdasarkan sekuen 16 rdna menunjukkan bahwa BC4 merupakan bakteri Staphylococcus epidermidis (Nawangsih et al. 2011). PGPR yang digunakan dalam penelitian adalah
18 Pseudomonas fluorescens RH4003 (P1) dan Bacillus subtilis AB89 (B12). PGPR tersebut merupakan hasil isolasi Nawangsih (2006) dari perakaran tomat. Peremajaan dilakukan dengan metode kuadran pada media Nutrient Agar (NA). Setalah didapatkan koloni tunggal kemudian digores secara merata pada media King s B. Peremajaan ini dilakukan secara berulang-ulang agar didapatkan isolat yang baik pada saat perlakuan dilakukan. a b c d e f Gambar 3 Biakan murni dan koloni tunggal S. epidermidis BC4 (a,b), B. subtilis AB89 (c,d), dan P. fluorescens RH4003 (e,f) pada medium NA dan King s B Media yang digunakan untuk pembuatan suspensi agens biokontrol adalah Nutrient Broth (NB). Suspensi S.epidermidis BC4, B. subtilis AB89, dan
19 P.fluorescens RH4003 yang digunakan untuk perlakuan memiliki kerapatan 10 9 sampai 10 10 cfu/ml. Proporsi kombinasi bakteri endofit dan PGPR yang digunakan untuk penyiraman tanaman uji ada 6 yaitu 0:0, 0:100, 25:75, 50:50, 75:25, 100:0. Terdapat 2 kombinasi yaitu S. epidermidis BC4 dengan B.subtilis AB89 dan S. epidermidis BC4 dengan P. fluorescens RH4003. Pembuatan suspensi dilakukan dengan cara menyiapkan isolat bakteri pada media agar (King s B). Koloni tunggal bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose kemudian digores secara merata pada media King s B dan diinkubasi selama 24 sampai 48 jam. Setelah koloni bakteri tumbuh, dimasukkan 5 ml air steril ke dalam media King s B dan di-scrub hingga koloni bakteri pada permukaan media lepas dan larut dalam air steril sehingga membentuk suspensi. Suspensi diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 250 ml NB serta diinkubasi pada inkubator bergoyang selama 72 jam pada kecepatan 100 rpm. Suspensi yang sudah siap kemudian ditambah dengan air dengan perbandingan 1:9 sehingga untuk 250 ml suspensi bakteri ditambahkan 2250 ml air. Uji Penekanan Kejadian Penyakit Inokulum patogen yang digunakan dalam penelitian berasal dari tanah pada areal pertanaman tanaman sakit dan dari tanaman tomat yang sakit. Pengecekan tanaman sakit dilakukan dengan cara memotong bagian pangkal batang tanaman sakit kemudian direndam di dalam air. Apabila oose (massa bakteri) keluar dari pangkal batang yang dipotong maka tanaman tomat tersebut terserang oleh R. solanacearum. Oose hasil rendaman pangkal batang dapat digoreskan pada media Tetrazolium Chloride (TZC) dan setelah diinkubasi pada suhu kamar selama 48 jam, koloni tunggal bakteri akan tumbuh. Koloni bakteri yang masih memiliki tingkat virulensi yang tinggi berwarna merah muda dan dikelilingi lendir yang berwarna keputihan seperti pada Gambar 1. Perbanyakan inokulum patogen dilakukan dengan cara memotong-motong tanaman sakit kemudian ditambahkan dengan air. Penambahan air ini bertujuan agar oose yang ada di dalam tanaman tomat dapat keluar. Setelah itu ditambahkan dengan tanah steril. Tanah campuran tanaman sakit dimasukkan ke dalam pot dan
20 ditanami tomat. Tomat yang layu dipotong-potong, ditambah air, dan dicampur dengan tanah steril lagi dan dilakukan berulang kali hingga didapatkan tanah yang mencukupi untuk infestasi. Perbanyakan dengan cara ini dilakukan untuk menjaga tingkat virulensi R. solanacearum pada saat pengujian karena tingkat virulensi R. solanacearum cepat menurun bila tidak terdapat inang. Media tanam yang digunakan dalam uji penekanan kejadian penyakit adalah tanah steril, pupuk kandang dan tanah yang telah diinfestasi R. solanacearum. Tanah steril dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:1 dicampur secara merata. Polybag yang digunakan dalam uji ini berukuran 30 cm X 30 cm. Isi polybag dibagi menjadi 3 bagian yaitu bagian bawah diisi dengan campuran tanah steril dan pupuk kandang, bagian tengah diisi dengan tanah yang diinfestasi R. solanacearum dan bagian atas diisi kembali dengan campuran tanah steril dan pupuk kandang. Setelah media tanam siap, bibit yang telah disiram dengan suspensi kombinasi sehari sebelum pindah tanam, ditanam pada media tersebut. Pada saat pindah tanam dilakukan pula penyiraman dengan suspensi kombinasi. Pemeliharaan dilakukan dengan menyiram tanaman 2 hari sekali dengan air. Namun, bila tanah masih lembab, maka tanaman tidak disiram. Pemeliharaan juga dilakukan dengan memasang ajir pada waktu tanaman tomat berumur 2 minggu setelah pindah tanam. Jumlah perlakuan pada uji ini adalah 10 perlakuan dengan 5 tanaman per perlakuan dan ditanam pada 3 blok yang berbeda sehingga didapatkan 50 tanaman per blok. Gambar 4 Biakan murni dan koloni tunggal R. solanacearum pada medium TZC, isolat yang virulen adalah isolat yang bagian tengah merah muda dikelilingi lendir berwarna putih (tanda panah).
Tanaman uji disiram dengan kombinasi PGPR dan bakteri endofit dua kali yaitu sehari sebelum pindah tanam dan dihari saat pindah tanam. Untuk penyiraman bibit sebelum maupun setelah pindah tanam diperlukan volume kombinasi 50 ml. Misal untuk proporsi kombinasi 25:75 maka disiapkan 12.5 ml bakteri endofit dan 37.5 ml PGPR. Untuk perbandingan 0:0 (kontrol) kombinasi hanya berisi 50 ml air untuk penyiraman bibit dan 50 ml air untuk penyiraman bibit setelah pindah tanam. Penyiraman suspensi bakteri sebelum pindah tanam diharapkan dapat memberi kesempatan bakteri endofit memasuki jaringan tanaman (bibit) sebelum dilakukan pindah tanam. Penyiraman saat pindah tanam dilakukan untuk menambah jumlah PGPR dan bakteri endofit dalam tanaman uji karena pada saat penyiraman sebelum pindah tanam PGPR dan bakteri endofit belum mengkolonisasi akar tanaman uji dengan baik (Nawangsih 2006). Tabel 1 Kode perlakuan dan proporsi suspensi bakteri dalam perlakuan pada uji penekanan penyakit Kode perlakuan Proporsi suspensi bakteri dalam perlakuan (%) S. epidermidis B. subtilis P. fluorescens Kontrol 0 0 0 BC0P100 a 0 0 100 BC25P75 25 0 75 BC50P50 50 0 50 BC75P25 75 0 25 BC100P0 100 0 0 BC0B100 0 100 0 BC25B75 25 75 0 BC50B50 50 50 0 BC75B25 75 25 0 a Kode isolat bakteri: P= Pseudomonas fluorescens RH4003, B= Bacillus subtilis AB89, BC= Staphylococcus epidermidis. Pengamatan terhadap masa inkubasi penyakit dilakukan dan dihitung mulai bibit ditanam sampai munculnya gejala pertama. Setelah itu, dilakukan pengamatan kejadian penyakit (KP) setiap minggunya. Kejadian penyakit dapat dihitung dengan rumus (Cooke 1998): 21 Keterangan: KP n N = Kejadian penyakit = jumlah tanaman yang terserang patogen = jumlah tanaman yang diamati
22 Setelah kejadian penyakit diketahui kemudian dihitung pula nilai AUDPC (Area Under Disease Progress Curve). AUDPC adalah total tingkat kejadian penyakit pada perlakuan dari minggu pertama pengamatan sampai minggu terakhir pengamatan. AUPDC dapat dihitung dengan rumus yang dinyatakan oleh Van der Plank (1963 dalam Cooke 1998) sebagai berikut: Keterangan: y = persentase kejadian penyakit t = hari Nilai AUDPC yang telah diketahui kemudian digunakan untuk menghitung indeks penekanan penyakit. Indeks penekenan penyakit adalah suatu angka yang dapat menyatakan tingkat keefektifan pengendalian suatu agens biokontrol terhadap patogen. Indeks penekanan penyakit dapat dihitung dengan rumus: Keterangan: DIc = AUDPC pada kontrol DIb = AUDPC pada perlakuan agens biokontrol Agens biokontrol yang digunakan dalam penelitian merupakan dua agens biokontrol yang dikokmbinasikan dengan berbagai proporsi. Untuk mengetahui tingkat sinergisme antara dua agens biokontrol tersebut digunakan rumus Abbott s (Guetsky et al. 2002), yaitu: ( ) ( ) dan ( ) ( ) Keterangan: SF a b E (exp) E (obs) = Synergy Factor = keefektifan pengendalian oleh agens biokontrol I = keefektifan pengendalian oleh agens biokontrol II = keefektifan pengendalian dugaan oleh campuran agens biokontrol = keefektifan pengendalian oleh campuran berdasarkan hasil pengamatan
23 Nilai SF yang telah diketahui akan dapat menunjukkan hubungan dua agens biokontrol dalam tanaman. Hubungan interaksi kedua agens biokontrol dapat ditentukan dengan ketentuan bila SF = 1 maka interaksi antar agens biokontrol bersifat additif, bila SF<1 maka interaksi antar agens biokontrol bersifat antagonis, bila SF>1 maka interaksi antar agens biokontrol bersifat sinergis (Guetsky et al. 2002). Uji Pemacuan Pertumbuhan Media tanam yang digunakan adalah tanah steril dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:1. Setelah media tanam steril siap, media tanam dimasukkan ke dalam polybag dengan ukuran 30 cm 30 cm dan kemudian ditanami bibit tomat yang telah disiram dengan suspensi kombinasi bakteri endofit dan PGPR sehari sebelum pindah tanam. Kemudian tanaman disiram kembali dengan kombinasi yang sama saat pindah tanam. Pemeliharaan dilakukan dengan menyiram tanaman 2 hari sekali. Namun, bila tanah masih lembab, maka tanaman tidak disiram. Pemeliharaan juga dilakukan dengan memasang ajir setelah tanaman tomat berumur 2 minggu setelah pindah tanam. Terdapat 10 perlakuan pada uji ini dan jumlah tanaman yang digunakan adalah 5 tanaman per perlakuan dengan 3 blok. Sehingga terdapat 50 tanaman pada 3 blok. Perlakuan yang diberikan sama dengan perlakuan pada uji penekanan penyakit (Tabel 1). Sama halnya dengan uji penekanan kejadian penyakit, pada uji pemacuan pertumbuhan juga dilakukan penyiraman kombinasi bakteri endofit dan PGPR sebanyak dua kali. Penyiraman ini dilakukan sesuai dengan perlakuan masing-masing tanaman uji. Pengamatan terhadap vigor tanaman dilakukan dengan mengukur tinggi tanaman dan bobot kering tanaman. Pengamatan terhadap tinggi tanaman dilakukan sampai tanaman berumur 42 hst setiap dua hari sekali. Bobot kering tanaman dihitung pada saat tanaman berumur 42 hst, kemudian tanaman dijemur selama 2 minggu dan dioven selama 24 jam. Pengeringan ini dilakukan agar tanaman tomat benar-benar kering dan didapatkan bobot kering yang konstan.
24 Data tinggi tanaman yang diperoleh kemudian digunakan dalam penghitungan nilai Area Under Height of Plant Growth Curve (AUHPGC). AUHPGC adalah total laju pertumbuhan tanaman. Nilai AUHPGC dapat dihitung menggunakan rumus yang dinyatakan oleh Van der Plank (1963 dalam Cooke 1998) sebagai berikut: Keterangan: y = laju pertambahan tinggi tanaman t = hari Rancangan Percobaan dan Analisis Data Penelitian dilakukan dengan melakukan 2 uji yaitu uji pemacu pertumbuhan dan uji penekanan kejadian penyakit dengan rancangan percobaan yang sama yaitu Rancangan Acak Kelompok (RAK). Data yang diperoleh akan dianalisis menggunakan analisis ragam (anova) dengan menggunakan program Statistical Analysis System (SAS) versi 9.1 dan dilanjutkan dengan uji Duncan dengan taraf 5%.