TESIS IDENTIFIKASI MOLEKULER VIRUS PENYEBAB PENYAKIT DAUN KUNING PADA TANAMAN MENTIMUN DI KECAMATAN BATURITI KABUPATEN TABANAN I DEWA MADE PUTRA WIRATAMA PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015
TESIS IDENTIFIKASI MOLEKULER VIRUS PENYEBAB PENYAKIT DAUN KUNING PADA TANAMAN MENTIMUN DI KECAMATAN BATURITI KABUPATEN TABANAN I DEWA MADE PUTRA WIRATAMA NIM 1390861004 PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015 i
IDENTIFIKASI MOLEKULER VIRUS PENYEBAB PENYAKIT DAUN KUNING PADA TANAMAN MENTIMUN DI KECAMATAN BATURITI KABUPATEN TABANAN Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Bioteknologi Pertanian, Program Pascasarjana Universitas Udayana I DEWA MADE PUTRA WIRATAMA NIM 1390861004 PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2015 ii
Lembar Pengesahan TESIS INI TELAH DISETUJUI TANGGAL 6 Juli 2015 Pembimbing I, Pembimbing II, Dr. G. N. Alit Susanta Wirya, S.P., M.Agr. Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. NIP. 19680115 199403 1 001 NIP. 19620607 198703 1 003 Mengetahui Ketua Program Studi Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana Universitas Udayana, Direktur Program Pascasarjana UniversitasUdayana, Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P. Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K). NIP. 19621009 198803 1 002 NIP. 19590215 198510 2 001 iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI Tesis ini Telah Diuji pada Tanggal 6 Juli 2015 Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, No. 2031 /UN14.4/ HK/2015, Tanggal 30 Juni 2015 Ketua : Dr. Gusti Ngurah Alit Susanta Wirya, S.P., M.Agr. Anggota : 1. Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. 2. Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P. 3. Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, M.S. 4. Dr. Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si. iv
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT Saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama : I Dewa Made Putra Wiratama NIM : 1390861004 Program studi : Bioteknologi Pertanian Judul Tesis : IDENTIFIKASI MOLEKULER VIRUS PENYEBAB PENYAKIT DAUN KUNING PADA TANAMAN MENTIMUN DI KECAMATAN BATURITI KABUPATEN TABANAN Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah tesis ini bebas plagiat. Apabila dikemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI No. 17 Tahun 2010 dan Peraturan Perundang-undangan yang berlaku. Denpasar, 6 Juli 2015 Yang membuat pernyataan (I Dewa Made Putra Wiratama) v
UCAPAN TERIMA KASIH Puji syukur penulis panjatkan kepada Ida Sang Hyang Widhi Wasa, karena atas asung kerta wara nugraha-nya, maka tesis yang berjudul Identifikasi Molekuler Virus Penyebab Penyakit Daun Kuning pada Tanaman Mentimun di Kecamatan Baturiti Kabupaten Tabanan. Tesis ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Bioteknologi Pertanian pada Program Pascasarjana Bioteknologi Pertanian Universitas Udayana. Penyusunan penelitian ini tidak terlepas dari dukungan dan bantuan dari berbagai pihak, pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan terima kasih kepada Dr. I Gusti Ngurah Alit Susanta Wirya, S.P., M.Agr sebagai Pembimbing I, yang telah memberikan dorongan, semangat, bimbingan, dan pengarahan selama penelitian dan penulisan tesis ini; Dr. Ir. Gede Suastika, M.Sc. selaku Pembimbing II, yang dengan penuh perhatian memberikan semangat, bimbingan dan saran selama penyelesaian tesis ini. Ucapan terima kasih penulis tujukan kepada Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, Sp.PD., KEMD, Ibu Direktur Pascasarjana Univeristas Udayana Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp. S(K) dan Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P., selaku Ketua Program Studi Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana Universitas Udayana atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister pada Program Pascasarjana Universitas Udayana serta seluruh staf dosen dan staf administrasi yang telah banyak membantu penulis selama menempuh pendidikan. Penulis pada kesempatan ini juga mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Bapak dan Ibu staf Laboratorium Virologi Institut Pertanian Bogor atas kerjasama dan kesempatan untuk belajar dan kemudahan dalam menggunakan fasilitas Laboratorium Virologi selama penulis melakukan penelitian. Ucapan terima kasih penulis sampaikan pula kepada para Penguji tesis, yaitu Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P., Prof. Dr. Ir. I vi
Made Sudana, M.S., dan Dr. Ir. I Dewa Nyoman Nyana, M.Si. yang telah memberikan banyak masukan, saran, dan arahan sehingga tesis ini dapat terwujud menjadi lebih baik. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan pada I Putu Sudiarta, S.P., M.Si., Ph.D, Ir. I Ketut Siadi,M.Si, Ir. I Gusti Ngurah Raka, M.S, Ir. I Ketut Sumiartha, M.Agr, I Made Sukewijaya, S.P., M.Sc., telah banyak member motivasi dan membantu penulis selama menempuh pendidikan. Ucapan terima kasih yang tulus penulis sampaikan kepada kedua orang tua tercinta I Dewa Putu Alit Jati dan Desak Ketut Puspawati, kakak I Dewa Gede Eka Suryawan S.E., Desak Ketut Novi Arisanti, S.H., M.Kn., dr. Dewa Gede Wirasaskara, S.Ked., adik Dewa Made Suarsana, Dewa Ayu Rita Purnama Dewi, S.K.G., Dewa Made Bagus Wahyu Saputra, bersama seluruh keluarga JINENG yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu atas dukungan, semangat dan do a selama penulis menyelesaikan pendidikan terutama penyusunan tesis ini. Akhirnya ucapan terima kasih penulis sampaikan juga atas perhatian dan motivasinya dari teman-teman Agroekoteknologi 09 ; teman-teman Biotek 13; teman-teman virologi di Fakultas Pertanian Universitas Udayana. Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa selalu melimpahkan rahmat-nya kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini. Semoga tesis ini dapat memberikan sumbangan bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan bermanfaat bagi semua. Denpasar, 6 Juli 2015 Penulis vii
ABSTRAK IDENTIFIKASI MOLEKULER VIRUS PENYEBAB PENYAKIT DAUN KUNING PADA TANAMAN MENTIMUN DI KECAMATAN BATURITI KABUPATEN TABANAN Mentimun (Cucumis sativus L.) merupakan salah satu jenis sayuran yang sudah popular di seluruh dunia. Peningkatan produksi mentimun sangat diperlukan karena semakin meningkatnya kebutuhan masyarakat akan mentimun. Virus merupakan salah satu penyakit utama pada mentimun yang menginduksi gejala kuning. Identitas dari virus yang berasosiasi dengan penyakit tersebut perlu diteliti agar tindakan penanganannya dapat dilakukan dengan tepat. Saat ini metode molekuler sudah tersedia untuk mengidentifikasi virus dengan lebih cepat dan akurat. Berdasarkan hal tersebut, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui jenis virus penyebab penyakit daun kuning pada tanaman mentimun di Tabanan, Bali dan kedekatan sikuen nukleotida pada jenis Begomovirus yang menginfeksi pertanaman mentimun di daerah Tabanan, Bali dengan jenis Begomovirus dari daerah lain. Penelitian ini menggunakan teknik RT-PCR dan PCR untuk mendeteksi virus tanaman dan dilanjutkan dengan perunutan sikuen nukleotida gen coat protein untuk dianalisis kedekatannya dengan beberapa isolat dari GeneBank. Hasil penelitian menunjukkan gejala penyakit daun kuning pada mentimun di Desa Bangli dan Desa Apuan, Kecamatan Baturiti, Kabupaten Tabanan, Bali berasosiasi dengan beberapa jenis virus kuning, diantaranya Crinivirus, Polerovirus dan Begomovirus. Anggota Begomovirus yang menginfeksi mentimun di Tabanan adalah Squash leaf curl China virus. Isolat Squash leaf curl China virus di Baturiti, Tabanan, Bali (isolat asal Indonesia) mempunyai similaritas tinggi (92%) dan jarak genetik yang terkecil (0,093) dengan isolat Squash leaf curl China virus yang berasal negara Malaysia. Penelitian ini adalah laporan pertama tanaman mentimun terinfeksi Squash leaf curl virus di Indonesia. Selanjutnya, diperlukan penelitian mengenai alternatif inang, epidemiologi, penyebaran penyakit, metode untuk mengurangi kepadatan populasi vektor SLCCV. Kata kunci : Mentimun, kuning, Begomovirus. viii
ABSTRACT IDENTIFICATION OF MOLECULAR VIRUS CAUSE DISEASES YELLOWING LEAF IN CUCUMBER (Cucumis sativus L.) IN BATURITI DISTRICT TABANAN REGENCY Cucumber (Cucumis sativus L.) is one of the kinds of vegetables that has been popular in the whole world. Required increased production of cucumbers. The virus is one of the major diseases that induce symptoms of yellowing. The identity of the virus that is associated with these diseases need to be examined in order to handle the action can be done properly. At this time, molecular methods had been available to identify the virus with more quickly and accurately. This study was conducted to determine the type of virus that causes yellowing leaf on cucumber plants in Tabanan, Bali and the similarity of the nucleotide sequence on the type of Begomovirus with Begomovirus kinds of other areas. This study used a technique of RT-PCR and PCR to detect plant viruses and followed by tracing the nucleotide sequence of coat protein genes to be analyzed similarity to several isolates of GeneBank. The results showed symptoms yellowing leaf on cucumbers in the village of Bangli and Apuan Village, District Baturiti, Tabanan, Bali is associated with some kind of virus yellows, including Crinivirus, Polerovirus and Begomovirus. Begomovirus members that infect cucumbers in Tabanan is Squash leaf curl China virus. Isolates Squash leaf curl China virus in Baturiti, Tabanan, Bali have a high similarity (91%) and genetic distance (0.093) with isolates Squash leaf curl China virus originating country of Malaysia. Next, needed research on alternative host, epidemiology, spread of disease, methods to reduce the vector population density SLCCV. Keywords : Cucumber, yellowing, Begomovirus. ix
RINGKASAN Mentimun (Cucumis sativus L.) merupakan salah satu jenis sayuran yang popular di seluruh dunia. Produktivitas mentimun sangat dipengaruhi oleh budidaya yang kurang intensif dan efisien, serta adanya gangguan hama dan penyakit. Virus adalah salah satu penyakit yang menginfeksi mentimun. Virus yang menginfeksi mentimun dapat menginduksi gejala mosaik (Potyvirus dan CMV) serta virus yang menginduksi gejala kuning (Crinivirus, Polerovirus dan Begomovirus). Lebih dari 80% tanaman mentimun di Kecamatan Baturiti, Kabupaten Tabanan, Bali memperlihatkan gejala daun berwarna kuning dengan jaringan di sekitar tulang daun masih tetap berwarna hijau (vein-banding) sehingga terlihat seperti menjari. Gejala yang menunjukkan vein banding pada tanaman mentimun mirip dengan gejala penyakit yang di induksi oleh kelompok virus dari golongan Crinivirus, Polerovirus dan Begomovirus. Keberadaan kutukebul (Bemisia tabaci) ditemukan belasan ekor per tanaman yang merupakan vektor dari Begomovirus menjadi indikasi adanya infeksi virus di pertanaman mentimun. Kejadian penyakit daun kuning pada tanaman mentimun merupakan kejadian baru di daerah Bali (belum ada yang melaporkan sebelumnya), sehingga identitas dari virus yang berasosiasi dengan penyakit tersebut perlu diteliti agar tindakan penanganannya dapat dilakukan dengan tepat. Saat ini metode molekuler sudah tersedia untuk mengidentifikasi virus dengan lebih cepat dan akurat. Berdasarkan fenomena tersebut, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui jenis virus penyebab penyakit daun kuning pada tanaman mentimun di Tabanan, Bali dan kedekatan sikuen nukleotida pada jenis Begomovirus yang menginfeksi pertanaman mentimun di Kecamatan Baturiti, Kabupaten Tabanan, Bali dengan jenis Begomovirus dari daerah lain. Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR). Hasil PCR divisualisasikan dalam gel agarosa pada elektroforesis. Hasil PCR yang positif selanjutnya dilakukan sekuensing untuk mendapatkan urutan x
nukleotida virus. Urutan nukleotida tersebut dijadikan dasar untuk mencari kesamaan virus di Tabanan dengan isolat virus dari daerah lain. Rekontruksi pohon filogeni menggunakan software MEGA 6 yang dikombinasikan dengan PAUP 4.0 dan Mr.Bayes 3.1.2. Hasil amplifikasi dari sepuluh (10) sampel daun mentimun yang bergejala kuning dari Desa Bangli dengan menggunakan primer Polerovirus (CP-F dancp-r) menunjukkan positif pada 650 pb ditemukan pada sembilan sampel kecuali sampel no.9 yaitu sampel kutukebul. Hasil amplifikasi dari sepuluh (10) sampel daun mentimun yang bergejala kuning dengan menggunakan primer BPYV1 dan BPYV2 (Crinivirus) hanya sampel no.5 yang menunjukkan positif pada ± 1500 pb. Sampel no. 5 merupakan sampel daun mentimun yang diambil dari Desa Bangli. Walaupun sampel 2 teramplifikasi tetapi tampilan pita DNA dalam elektroforesis masih sangat tipis. Hasil amplifikasi dari sampel daun mentimun yang bergejala kuning di Desa Bangli dan Desa Apuan dengan menggunakan primer universal Begomovirus (SPG1 dan SPG2) menunjukkan positif pada 910 pb. Sampel 1, 2, 3, 4, 5, 6, sampel 11 s/d 13 14 s/d 17 dan 20 s/d 22 merupakan sampel daun mentimun yang berasal dari Desa Bangli. Sedangkan sampel 18 dan 19 merupakan sampel daun mentimun yang diisolasi dari Desa Apuan. Sampel-sampel yang menunjukkan positif Begomovirus selanjutnya akan dilakukan perunutan DNA. Tingkat homologi di Gene Bank menunjukkan jika isolat Tabanan (Desa apuan dan Desa Bangli) memiliki nilai tertinggi jika dibandingkan dengan isolat Squash leaf curl virus yang berasal dari Vietnam, China dan Malaysia yang nilainya mencapai 91%. Sedangkan jika dilihat dari jarak genetiknya, isolat Apuan memiliki jarak genetik terendah dengan isolat Squash leaf curl virus yang berasal dari Malaysia sebesar 0,093. Rekontruksi pohon filogenetik menunjukkan isolat Tabanan berada dalam subsubsubkelompok yang sama dengan isolat Squash leaf curl virus yang berasal dari Malaysia yang didukung dengan nilai bootstrap pada percabangannya sebesar 76%. xi
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa gejala penyakit kuning atau klorosis pada mentimun di Desa Bangli dan Desa apuan, Kecamatan Baturiti, Kabupaten Tabanan, Bali berasosiasi dengan infeksi beberapa jenis virus, diantaranya Crinivirus, Polerovirus dan Begomovirus. Anggota Begomovirus yang menginfeksi mentimun di Tabanan adalah Squash leaf curl China virus. Isolat Squash leaf curl China virus di Baturiti, Tabanan, Bali mempunyai similaritas tinggi (92%) dan jarak genetik terendah (0,093) dengan isolat Squash leaf curl China virus yang berasal negara Malaysia. Penelitian ini adalah laporan pertama tanaman mentimun terinfeksi SLCCV di Indonesia. Untuk studi di masa depan, diperlukan penelitian mengenai alternatif inang SLCCV, epidemiologi, penyebaran penyakit oleh kutukebul sebagai vektor dan metode untuk mengurangi kepadatan populasi vektor dan insiden penyakit di pertanaman mentimun. xii
DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM... i PRASYARAT GELAR... ii LEMBAR PENGESAHAN... iii PENETAPAN PANITIA PENGUJI... iv SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT... v UCAPAN TERIMAKASIH... vi ABSTRAK... viii ABSTRACT... ix RINGKASAN... x DAFTAR ISI... xiii DAFTAR TABEL... xvi DAFTAR GAMBAR... xvii DAFTAR LAMPIRAN... xviii BAB I PENDAHULUAN... 1 1.1 Latar Belakang... 1 1.2 Rumusan Masalah... 5 1.3 Tujuan Penelitian... 5 1.4 Manfaat Penelitian... 5 BAB II KAJIAN PUSTAKA... 6 2.1 Mentimun (Cucumis sativus L.)... 6 2.2 Penyakit Daun Kuning Pada Tanaman Mentimun dan Virus yang Berasosiasi... 7 2.2.1 Genus Polerovirus... 8 2.2.1.1 Karakter Molekuler Polerovirus... 8 xiii
2.2.1.2 Gejala Infeksi Polerovirus... 8 2.2.2 Genus Crinivirus... 9 2.2.2.1 Karakter Molekuler Crinivirus... 9 2.2.2.2 Gejala Infeksi Crinivirus... 10 2.2.3 Genus Begomovirus... 11 2.2.3.1 Karakter Molekuler Begomovirus... 13 2.2.3.2 Gejala Infeksi Begomovirus... 15 2.3 Deteksi dan Identifikasi Virus Secara Molekuler... 16 2.3.1. Polymer Chain Reaction (PCR)... 16 2.3.1. Reverse Transcriptase Polymer Chain Reaction (RT-PCR)... 19 2.4 Analisis Filogenetika Molekuler... 19 2.4.1 Sequence Alignment... 19 2.4.2 Rekontruksi Pohon Filogenetika... 20 2.4.1 Evaluasi Pohon Filogenetika... 21 2.5 Program Komputer... 21 BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS... 23 3.1 Kerangka Berpikir... 23 3.2 Konsep Penelitian... 28 3.3 Hipotesis... 35 BAB IV METODE PENELITIAN... 36 4.1. Tempat dan Waktu Penelitian... 36 4.2 Pengumpulan Sampel Tanaman Mentimun Terinfeksi Virus... 36 4.3 Deteksi Beberapa Virus pada Sampel Daun dari Lapangan... 36 xiv
4.3.1. Reverse Transcriptase Polymer Chain Reaction (RT-PCR)... 37 4.3.1.1. Ekstraksi RNA Total Daun Mentimun... 37 4.3.1.2. Ekstraksi RNA Total Kutukebul... 39 4.3.1.3. Sintesis complementary DNA (cdna)... 39 4.3.1.4. Amplifikasi cdna... 40 4.3.2. Polymer Chain Reaction (PCR)... 41 4.3.2.1. Ekstraksi DNA... 41 4.3.2.2. Amplifikasi DNA... 42 4.4. Visualisasi Hasil Amplifikasi DNA... 43 4.5. Sikuen Nukleotida... 44 4.6. Analisis Keragaman Genetik... 44 BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN... 45 5.1. Gejala Infeksi Virus pada Tanaman Mentimun di Lapangan. 45 5.2. Deteksi Molekular Gejala Kuning atau Klorosis pada Daun Mentimun... 48 5.3. Perunutan DNA Begomovirus... 55 5.4 Analisis Hubungan Kekerabatan Antara Isolat-Isolat Squash leaf curl virus (SLCV)... 55 BAB V SIMPULAN DAN SARAN... 67 DAFTAR PUSTAKA... 68 LAMPIRAN 77 xv
DAFTAR TABEL Halaman 4.1 Komposisi reaktan reverse transcription (RT) untuk satu kali reaksi sintesis komplementari DNA terhadap RNA genom Crinivirus,Polevirus dan kutukebul... 40 5.1 Daftar Isolat Begomovirus dari Bangli dan Apuan... 55 5.2 Matrix jarak genetik isolat Squash leaf curl virus dan Tomato leaf curl virus yang berasal dari Negara berbeda... 57 5.3 Tingkat kesamaan isolat Tabanan dengan Squash leaf curl virus dan Tomato leaf curl virus dari beberapa negara... 59 xvi
DAFTAR GAMBAR Halaman 2.1 Struktur genom dari Lettuce infectious yellows virus (LIYV), tipe spesies dari genus Crinivirus... 10 2.2 Organisasi genom DNA-A dan DNA-B Begomovirus... 14 3.1 Bagan kerangka berpikir... 28 3.2 Bagan kerangka konsep penelitian... 34 5.1 Variasi gejala (A; gejala mosaik) dan (B; gejala kuning) pada pertanaman mentimun di Desa Apuan dan Desa Bangli, Kabupaten Tabanan... 45 5.2 Gejala daun mentimun menguning dengan tulang daun masih tetap berwarna hijau (gambar C) dan daun mentimun menguning yang disertai dengan menggulung ke bawah (gambar D)... 46 5.3 Visualisasi pita DNA Polerovirus hasil amplifikasi menggunakan primer PeVYV pada gel agragose 1 %.... 49 5.4 Visualisasi pita DNA Crinivirus hasil amplifikasi menggunakan primer BPYV pada gel agragose 1 %..... 51 5.5 Visualisasi pita DNA Begomovirus hasil amplifikasi menggunakan pasangan primer SPG1/SPG2 pada gel agragose 1 %. 53 5.6 Hubungan kekerabatan 17 isolat virus hasil analisis kelompok berdasarkan pola pita DNA dengan metode Baysian... 61 xvii
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Penyejajaran urutan nukleotida fragmen DNA isolat Squash leaf curl China virus Apuan dan Bangli dengan isolat Squash leaf curl China virus lainnya yang terdapat di GeneBank. Tanda * (bintang) menunjukkan basa nukleotida yang identik... 77 xviii