33 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Pemeliharaan ikan dilakukan di Laboratorium Sistem dan Teknologi Budidaya, IPB. Histologi gonad dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan (LKI), uji glukosa dan osmolaritas darah dilakukan di Laboratorium Embriologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Proksimat protein dan lemak pakan dan ikan di lakukan di Laboratorium Pusat Antar Universitas (PAU), IPB. Pengamatan diameter oosit dilakukan di Laboratorium Reproduksi dan Genetika organisme Akuatik, BDP IPB. Pelaksanaan penelitian dilakukan selama + 4 bulan. Alat dan Bahan Wadah dan Media Percobaan Wadah yang digunakan berupa bak terpal berukuran 65x60x50 cm sebanyak 27 unit (Lampiran 1). Setiap wadah di isi air sebanyak 150 liter, dilengkapi filter dan aerasi. Media percobaan (Lampiran 2) yang digunakan adalah bersalinitas 10 ppt, 20 ppt dan media air tawar (0 ppt). Untuk mempermudah penggunaan atau pergantian air selama pemeliharaan, disiapkan empat buah bak tandon masing-masing untuk menampung air bersalinitas 10 ppt, 20 ppt, 30 ppt dan air tawar yang sudah diencerkan terlebih dulu dan diareasi. Ikan Uji Ikan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah induk betina ikan nila merah (Oreochromis sp.) hasil budidaya di Kolam Departemen Budidaya Perairan. Jumlah total induk yang disediakan adalah 200 ekor dan sebanyak 108 ekor dipilih secara selektif dengan bobot yang sama (200-300 g/ekor) untuk digunakan sebagai ikan uji perlakuan. Lima ekor ikan nila diambil sebagai data awal untuk dianalisa tingkat kematangan gonad sebelum diberi perlakuan. Bahan Uji Untuk bahan perlakuan menggunakan hormon tiroksin berupa tablet dengan dosis per tablet adalah setara dengan 100 µg tiroksin. Sebelum diberi perlakuan, sebanyak 10 gr (1000 µg tiroksin) terlebih dahulu digerus dengan
34 menggunakan mortar hingga halus (berbentuk bubuk), kemudian dilarutkan ke dalam 20 ml larutan dimetilsulfoksida (DMSO). Larutan kemudian didiamkan selama 24 jam dalam magnetik spiral agar hormon tiroksin benar-benar larut. Larutan (tiroksin + DMSO) kemudian diambil dengan menggunakan suntikan syringe 1 ml dan siap diinjeksi ke ikan dengan dosis sesuai masing-masing perlakuan. Pelaksanaan Penelitian Persiapan Induk Induk nila yang diambil dari kolam diangkut kedalam wadah pemeliharaan berupa bak beton dan fiber yang telah disiapkan terlebih dulu. Air disiapkan seminggu sebelum ikan diambil, dilengkapi dengan sistem filter dan aerasi. Ikan dipelihara selama + seminggu dengan pemberian pakan secara at satiation. Penyiponan dilakukan dua hari sekali untuk menghindari kotoran mengendap di dasar bak dan dilakukan pergantian air sebanyak 50 %. Adaptasi Induk Induk yang telah dipelihara sebelumnya dipindahkan ke masing-masing wadah percobaan dengan kepadatan 4 ekor/bak. Peningkatan salinitas dilakukan setelah tiga hari pemindahan ikan. Untuk menghindari stres, dilakukan peningkatan salinitas secara bertahap dengan perubahan 2-4 ppt setiap harinya hingga mencapai delapan hari. Teknik Penyuntikan Penyuntikan dilakukan seminggu setelah ikan sudah mampu beradaptasi dengan media pemeliharaan bersalinitas; dilakukan secara intra muscular (IM), yaitu pada daerah antara pangkal sirip punggung dengan linea lateralisnya sebanyak dua minggu sekali, dimulai minggu pertama pemeliharaan hingga minggu keenam. Penyuntikan menggunakan spuit syringe 1 ml dengan dosis sesuai pada masing-masing perlakuan. Untuk mengurangi tingkat stres, ikan nila dipuasakan sehari sebelum penyuntikan dilakukan; bersamaan dengan pembuatan larutan hormon tiroksin.
35 Pemberian Pakan Pakan uji yang diberikan adalah pelet komersial dengan kandungan protein sebesar 30-33% dan lemak sebesar 11,6 %. Pemberian dilakukan dua kali sehari yaitu pagi (08: 00) dan sore (06: 00) secara at satiation. Prosedur Pengambilan Sampel Darah Pengambilan sampel darah untuk pengukuran kandungan kadar glukosa dan osmolaritas tubuh ikan nila dilakukan dengan mengambil sebanyak 3 ml sampel darah ikan pada bagian pangkal ekor dengan menggunakan spuit 3 ml yang telah diberi antikoagulan (cirate-phosphate-sextrosesolution, Sigma C-7165) agar darah tidak beku. Sampel darah dimasukkan ke dalam tabung polietilen dan disentrifus pada kecepatan 600 rpm selama 5 menit. Plasma darah hasil sentrifus diambil dan dipindahkan ke tabung polietilen baru untuk disimpan dalam freezer (-20 o C) sampai dilakukan analisis. Pengambilan Data dan Pengukuran Kualitas Air Sampling (pengambilan data) penelitian dilakukan pada awal penelitian yaitu hari ke-0 pemeliharaan, hari ke-14 dan seterusnya hingga hari ke-56; diambil secara teratur dengan interval waktu 14 hari sampai hari akhir penelitian. Sampling ikan meliputi perkembangan gonad, GSI dan HSI, diameter telur, gradient osmotik, glukosa darah, tingkat konsumsi oksigen, dan pertumbuhan. Perkembangan gonad diikuti dengan mengamati histologi gonad (Lampiran 3). Analisis proksimat lemak dan protein daging ikan nila dilakukan pada akhir penelitian. Kualitas air diukur setiap minggu meliputi suhu, ph dan oksigen. Untuk mengetahui perubahan yang terjadi pada gonad secara kuantitatif dilakukan pengukuran gonad somatik indek (GSI), diameter telur dan fekunditas. Pengukuran GSI dilakukan dengan cara membedah ikan untuk diambil gonadnya kemudian ditimbang. Penimbangan dilakukan dengan menggunakan timbangan analitik.; gonad diambil sebanyak tiga ekor per perlakuan. Data fekunditas diperoleh dengan menghitung jumlah total telur yang terdapat dalam gonad, sedangkan diameter telur diukur dibawah mikroskop yang dilengkapi mikrometer,
36 dengan pembesaran 40x. Jumlah telur yang diamati adalah 100 butir per gonad (300 butir/perlakuan). Rancangan Penelitan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL dua faktor) dengan pola faktorial 3 x 3. Dosis hormon sebagai faktor pertama dengan level konsentrasi 0 ng/g BW, 50 ng/g BW, 100 ng/g BW dan salinitas sebagai faktor kedua dengan level 0 ppt, 10 ppt dan 20 ppt. Keseluruhan percobaan terdiri atas sembilan kombinasi perlakuan, dan masing-masing perlakuan diulang sebanyak tiga kali sehingga jumlah satuan percobaan sebanyak 27 (Tabel 2). Tabel 2. Perlakuan percobaan kajian reproduksi ikan nila merah (Oreochromis sp.) setelah pemberian tiroksin dan dipelihara pada beberapa media salinitas Tiroksin (ng/g BT) Salinitas (ppt) 0 10 20 0 A (T0:S0) B (T0:S10) C (T0:S20) 50 D (T50:S0) E (T50:S10) F (T50:S20) 100 G (T100:S0) H (T100:S10) I (T100:S20) Keterangan : BT = Bobot tubuh Setiap perlakuan menggunakan tiga wadah dan tiap wadah diisi empat ekor ikan sehingga setiap perlakuan terdiri dari 12 ekor ikan. Sebanyak 27 ekor ikan akan diambil setiap 14 hari dengan masing-masing perlakuan sebanyak tiga ekor untuk dilakukan analisa kematangan gonad, diameter telur dan parameter penunjang lainnya. Dimana : Model rancangan penelitian yang digunakan adalah : Yij = µ + αi + βj + (αβ)ij + ijk Yijk = Nilai pengamatan pada faktor ke 1 taraf ke-i, faktor 2 taraf ke-j, dan ulangan ke-k µ = Rata-rata umum ti = Pengaruh faktor 1 (dosis hormon)
37 βj = Pengaruh faktor 2 (salinitas) (αβ)ij = Komponen interaksi dari faktor 1 dan faktor 2 ij = Pengaruh acak yang menyebar normal Parameter Uji yang Diamati Parameter uji yang diamati dalam penelitian ini terdiri dari parameter utama dan parameter pendukung. Parameter utama berupa diameter oosit, fekunditas, gonad somatik indeks (GSI) dan HSI (hepato somatik indeks). Parameter pendukung berupa pertumbuhan, kadar glukosa darah, gradient osmotik, tingkat konsumsi oksigen (TKO), retensi lemak dan retensi protein. Parameter Utama Penentuan Diameter Oosit Diameter oosit diamati dengan mengambil sampel telur secara acak pada gonad ikan sebanyak 100 butir/ekor. Sampel telur kemudian difiksasi dengan alkohol 70%. Diameter telur diukur menggunakan mikroskop yang dilengkapi dengan mikrometer okuler. Sampel telur yang telah diukur dihitung rataannya dan dibuat distribusi frekuensi panjang total dan diameter telur (mm) dengan menggunakan rumus (Mattjik dan Sumertajaya 2000): Menentukan nilai maksimum dan minimum dari keseluruhan data Menghitung jumlah kelas ukuran dengan rumus : K=1+(3,32 log ); K = jumlah kelas ukuran, n = jumlah data pengamatan. Menghitung rentang data/wilayah (wilayah = data terbesar-data terkecil). Menghitung lebar kelas (lebar kelas = wilayah dibagi dengan jumlah kelas). Menentukan limit bawah kelas bagi selang kelas yang pertama dan limit atas kelasnya. Limit atas kelas diperoleh dengan menambahkan lebar kelas pada limit bawah. Mendaftarkan semua limit kelas untuk setiap selang kelas Menentukan nilai tengah bagi masing-masing selang dengan merata-ratakan limit atas.
38 Fekunditas Menentukan frekuensi bagi masing-masing kelas Menjumlahkan frekuensi dan memastikan apakah hasilnya sama dengan banyaknya total pengamatan serta membuat histogram (Lampiran 6). Fekunditas merupakan jumlah telur yang akan dikeluarkan oleh induk pada saat memijah. Fekunditas dihitung dengan menggunakan rumus berikut : Keterangan : F = (G x X) Q x W F : Fekunditas (butir telur/kg bobot tubuh) G : Bobot telur individu/gonad (g) X : Jumlah telur sampel (butir) Q : Bobot telur sampel (g) W : Bobot tubuh individu (g) Gonad Somatik Indeks (GSI, %) GSI (%) = Hepato Somatik Indeks (HSI, %) HSI (%) = Bobot gonad Bobot tubuh x 100 Bobot hepato Bobot tubuh x 100 Parameter Pendukung Gradien Osmotik Gradien osmotik dihitung berdasarkan formula yang digunakan oleh Anggoro (1992). Pengukuran gradien osmotik disajikan dalam Lampiran 4. Gradien osmotik dinyatakan sebagai tingkat konsumsi oksogen (TKO). TKO = Osmolaritas darah ikan (mosm/lh 2 O) Osmolaritas media (mosm/lh 2 O).
39 Tingkat Konsumsi Oksigen (TKO s) TKO s diukur dengan menghitung rasio oksigen terlarut pada awal dan akhir penelitian per satuan waktu. Metode pengukuran dengan menggunakan akuarium bervolume 30x30x25 cm. Air diaerasi selama 1 hari sehingga jenuh oksigen. Sebelum ikan dimasukkan kedalam wadah, kandungan oksigen awal dihitung. Selanjutnya satu ekor ikan yang sebelumnya telah dipuasakan selama satu hari ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam wadah. Setelah satu jam, dihitung lagi DO akhirnya. TKO s diperoleh dengan menggunakan persamaan berikut (Pavlovskii 1964). TKO s = {(DO awal DO akhir)/w x t} x V Keterangan: TKO s : Tingkat konsumsi oksigen (mg O 2 /gr tubuh/jam) DO awal : Oksigen terlarut pada awal pengamatan (mg/l) DO akhir : Oksigen terlarut pada akhir pengamatan (mg/l) W : Berat ikan uji (gr) T : Periode pengamatan (jam) V : Volume air dalam respirometer (L) Kadar Glukosa Darah Pemeriksaan kadar glukosa darah digunakan sebagai indikator stress sekunder akibat perlakuan. Prosedur pengukuran kadar glukosa darah disajikan dalam Lampiran 5. Pengukuran dihitung dengan menggunakan rumus : Keterangan: GD = AbsSp AbsSt x GSt [ GD ] : Konsentrasi glukosa darah (mg/ml) AbsSp AbsSt : Absorbansi sampel : Absorbansi standar [ GSt ] : Konsentrasi glukosa standar (mg/ml)
40 Retensi Protein (%) Keterangan : Retensi protein dihitung berdasarkan persamaan (Takeuchi, 1998) RP = Retensi protein (%) F P RL = F I P x 100% = Jumlah lemak tubuh pada awal pemeliharaan = Jumlah protein yang dikonsumsi ikan Retensi Lemak (%) Keterangan : Retensi lemak dihitung berdasarkan persamaan (Takeuchi, 1998) RL = Retensi lemak (%) F P RP = F I P x 100% = Jumlah lemak tubuh pada awal pemeliharaan = Jumlah protein yang dikonsumsi ikan Pertumbuhan ikan Data laju pertumbuhan ikan uji diperoleh dengan melakukan pengambilan ikan uji awal dan akhir penelitian, kemudian ditimbang beratnya. Laju pertumbuhan ikan dianalisa dengan menggunakan rumus berikut : Wt t 1 x 100 Wo Dimana: α = Laju pertumbuhan bobot rerata harian (%) Wt = Bobot rata-rata individu pada waktu t (g) Wo = Bobot rata-rata individu pada waktu t 0 (g) t = Lama percobaan (hari)
41 Analisa Data Data yang diperoleh dari hasil penelitian dibuat tabulasi kemudian dilakukan analisis sidik ragam (ANOVA) dengan uji F. Jika pada setiap perlakuan terdapat pengaruh nyata terhadap respon yang diamati dilakukan uji lanjut Duncan. Jika tidak terdapat perbedaan nyata (P>0,05) maka semua data akan dianalisis secara deskriptif dalam bentuk tabel dan grafik. Sebagai alat bantu untuk pengelolaan data dalam uji statistik digunakan program SPSS 17 (Steel and Torrie 1993).