29 6 FRAKSINASI DAN ISOLASI PROTEIN WHEY SUSU KUDA SUMBA Abstract The aims of this study were to fractionate and to isolation antimicrobial activity of Sumba mare s milk protein against causative agent of subclinical mastitis. Fractionation of antimicrobial compounds of whey proteins in milk using high performance liquid chromatography (HPLC) method. Antimicrobial compounds isolation of whey proteins were fractionate using alkaline alumina column. The results of fractionation of antimicrobial compounds using HPLC method, there are six main peaks conferring to their different retention times. Isolation results of six fraction with different polarity levels. Keyword: mare s milk, protein fractionation, HPLC Abstrak Tujuan penelitian ini untuk melakukan fraksinasi dan isolasi senyawa antimikroba protein susu kuda sumba. Fraksinasi senyawa antimikroba dalam protein whey susu menggunakan metode high perfomance liquid chromatography (HPLC). Isolasi senyawa antimikroba dalam protein whey dilakukan dengan memfraksinasi protein whey menggunakan kolom alumina basa. Berdasarkan hasil identifikasi senyawa antimikroba menggunakan HPLC, terdapat 6 (enam) peak utama dengan waktu retensi yang berbeda. Hasil isolasi diperoleh 6 (enam) fraksi dengan tingkat kepolaran berbeda. Kata kunci: susu kuda, fraksinasi protein, HPLC Pendahuluan Protein susu memiliki susunan asam amino esensial yang relatif lengkap berfungsi sebagai antimikroba dan imunomodulator (Ebringer et al. 2008). Protein susu kuda mengandung dua komponen utama yaitu kasein dan whey. Pada susu kuda perbandingan whey dan kasein 1:1.1 (Malacarne et al. 2002). Kandungan whey pada susu kuda sekitar 38% dari total protein, berbeda dengan susu sapi yang memiliki kandungan whey sekitar 20% dari total protein susu (Uniacke-Lowe et al. 2010). Komponen whey susu yang paling berperan dalam fungsi antimikroba dan imunomodulator untuk bayi dan orang dewasa terdiri dari imunoglobulin, lisosim dan laktoferin (Lo pez et al. 2006; Markiewicz-Keszycka et al. 2013). Aktivitas antimikroba yang ada pada whey menyebabkan susu dapat bertahan terhadap beberapa bakteri pembusuk dan memiliki waktu simpan yang lebih lama (Naidu 2002). Penelitian yang telah dilakukan oleh Hermawati et al. (2004) diketahui bahwa susu kuda sumbawa memiliki potensi sebagai antimikroba terhadap 9 jenis bakteri patogen perusak pangan. Susu kuda sumbawa juga telah diteliti oleh
30 Rijatmoko (2003) dan Pana (2004) terhadap aktivitas antimikroba Mycobacterium tuberculosis. Dalam studi lainnya ditemukan bahwa kolostrum susu kuda sumbawa memiliki daya antimikroba terhadap Bacillus anthracis (Makmun dan Purwanta 2008). Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi whey protein dari susu kuda sumba dengan melakukan fraksinasi dan isolasi senyawa antimikroba protein whey. Protein antimikroba dari susu kuda diharapkan dapat diaplikasikan pada berbagai kondisi penyakit. Bahan dan Metode Bahan dan Alat Sebanyak 40 sampel susu kuda sumba diambil dari peternakan kuda di Kabupaten Sumba Timur dan Sumba Tengah dan disimpan dalam coolbox untuk ditransportasikan sekitar 3-6 jam untuk disimpan pada lemari pendingin (freezer), kemudian sampel didistribusikan menuju laboratorium tempat pelaksanaan penelitian. Bahan yang digunakan untuk pemisahan whey susu kuda yaitu 2 N HCl, 2 N NaOH dan alat yang digunakan yaitu sentrifus, ph meter, tabung sentrifus, tabung penampung supernatan. Bahan untuk ekstraksi, clean up, proses fraksinasi dan isolasi laktoferin pada susu kuda sumba terdiri dari: whey susu kuda, laktoferin, etanol, methanol, etil asetat, n-hexan, aseton, sodium acetat anhidrate, asam klorida, sodium hidroksida, asetonitril, akuades dan alat yang digunakan yaitu evaporator, saringan 0.5 µm dan 0.22 µm, satu unit HPLC Shimadzu LC 10A system yang terdiri dari: Pump LC-6A, Detector UV visible, Injector type sil 10-A, column C18 4.6 x 250 mm. Fraksinasi dan Isolasi Senyawa Antimikroba dalam Protein Whey Susu Kuda sumba Identifikasi senyawa antimikroba dalam protein whey susu kuda sumba diawali dengan proses pemisahan whey. Lemak susu kuda dipisah melalui proses sentrifus dengan kecepatan 2 000 g pada suhu 4 o C, selama 30 menit, sehingga diperoleh susu skim. Pengasaman susu skim hingga mencapai ph 4.2 dilakukan dengan menambahkan 2 N HCl (Girardet et al. 2004). Larutan kemudian disentrifus dengan kecepatan 10 000 g pada suhu 4 o C, selama 30 menit. Endapan kasein dibuang, whey asam dinetralisasi menggunakan 2 N NaOH sampai ph mencapai 6.8 dan dilakukan proses sentrifus pada 10 000 g pada suhu 4 o C, selama 30 menit. Supernatan yang diperoleh adalah whey netral, sedangkan endapan yang tersisa adalah kasein (Bertram et al. 2008; Yoshida et al. 2000; Kappeler et al. 1999). Proses pembersihan whey netral dilakukan menggunakan cartridge seppak C-18. Larutan yang mengandung protein ditampung dan dievaporasi untuk menghilangkan metanol dan residu lainnya, kemudian whey disaring menggunakan saringan whatman 0.2 µm dan dimasukkan pada tabung 1 ml untuk diinjek pada high performance liquid chromatography (HPLC). Fase gerak yang digunakan adalah campuran air suling, asetonitril (ACN) dengan perbandingan 95:5 dan ditambahkan trifluoroacetic acid (TFA) 0.1% (Markiewicz-Ke szycka et al. 2013; Drackova et al. 2009). Jenis detektor yang digunakan pada HPLC
adalah UV detector dengan panjang gelombang 220 nm dan C-18 fase terbalik. Peak yang muncul pada HPLC diamati berdasarkan waktu retensinya. Fraksinasi dan isolasi dilakukan melalui pembuatan kolom manual alumina basa dengan memasukan alumina basa ke dalam tabung buret dan direndam dalam metanol, dibiarkan selama satu malam. Larutan berdasarkan tingkat kepolaran dari yang terendah hingga tertinggi yaitu klorofom, etil asetat, aseton, metanol, asetonitril dan air destilasi, dimasukkan ke dalam buret. Protein whey susu kuda sumba dimasukkan ke dalam buret, selanjutnya terlihat batas antara setiap larutan yang mengindikasikan adanya senyawa yang berbeda-beda pada susu kuda sumba. Isolasi fraksi dilakukan dengan menampung fraksi whey berdasarkan batas yang terlihat didinding tabung (Gambar 7). Setiap fraksi dimasukkan ke dalam tabung dan dievaporasi sampai kering, kemudian ditambahkan air destilasi dan dihomogenkan dengan vorteks. Selanjutkan tabung labu dimasukan ke dalam mesin sonifikasi untuk menghilangkan gelembung udara. Sebelum dilanjutkan proses bioassay, fraksi whey disaring dengan kertas whatman berukuran 0.2 µm (Rouessac dan Rouessac 2007) 31 Buret whey Whey FD FD Fraksi 1,2,3,4,5,6 A B C Gambar 7 Proses isolasi sampel menggunakan alumina basa (A) komponen alumina basa, : fase gerak, FD: fase diam; (B) proses memasukan sampel ke dalam kolom (C) proses elusi dan pemisahan sampel Hasil dan Pembahasan Fraksinasi Senyawa Antimikroba dalam Protein Whey Susu Kuda Sumba Berdasarkan hasil pengujian sampel menggunakan HPLC terdapat enam peak utama yang muncul pada kromatogram. Keenam peak yang muncul secara berurutan dengan waktu retensi masing-masing adalah 4.091, 4.349, 4.516, 5.336,
32 5.721, 8.779 (Gambar 8). Kolom C-18 pada HPLC mengikat molekul bersifat non polar sehingga peak yang keluar paling awal bersifat polar diikuti senyawa bersifat non polar. Peak yang muncul pada kromatogram menunjukkan adanya senyawa-senyawa dalam protein whey susu dengan tingkat polaritas yang berbeda. Waktu retensi (menit) Gambar 8 Kromatogram protein whey susu kuda sumba menggunakan HPLC Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Melalui prinsip ini, maka berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisis dengan menggunakan detektor yang menunjukkan waktu retensi dari molekul. Waktu retensi bervariasi tergantung interaksi antara fase diam, molekul yang dianalisis dan pelarut yang digunakan (Martin dan Guiochon 2005). Prinsip pemisahan molekul oleh kromatografi berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen yang berada pada larutan. Sampel yang dianalisis dalam volume yang kecil dialirkan bersama fase gerak dan dihambat oleh bahan kimia tertentu atau interaksi fisik dalam fase diam (kolom). Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah (Liu dan Lee 2006; Rouessac dan Rouessac 2007). Isolasi Protein yang ada pada whey susu kuda sumba Senyawa yang teridentifikasi pada kromatogram kemudian difraksinasi menggunakan alumina basa untuk mengisolasi senyawa yang diduga sebagai zat antimikroba dalam protein whey susu. Penggunaan kolom alumina basa sebagai fase diam memudahkan dalam proses penampungan fraksi untuk dilanjutkan pada pengujian kemampuan antimikrobanya. Larutan yang digunakan sebagai fase
gerak yaitu klorofom, etil asetat, aseton, metanol, asetonitril dan air destilasi. Setiap senyawa yang ada pada whey protein larut pada larutan yang digunakan sebagai fase gerak berdasarkan tingkat polaritasnya. Kolom alumina basa mampu mengikat senyawa polar sehingga dalam proses fraksinasi, senyawa yang non polar akan keluar terlebih dahulu dan diikuti senyawa polar. Larutan hasil fraksinasi yang muncul ditampung dan dievaporasi untuk menghilangkan sisa larutan yang berasal dari fase geraknya. Hal ini dilakukan agar sifat antimikroba fraksi bukan berasal dari larutan dari fase gerak yang digunakan. Pemurnian didefinisikan sebagai proses pemisahan atau ekstraksi senyawa target dari campuran senyawa atau kontaminan. Prinsip fraksinasi adalah memisahkan bahan terlarut menjadi fraksi-fraksi dengan aliran fase yang dialirkan ke dalam fase stationer (diam). Setiap senyawa memiliki puncak pada kromatogram berdasarkan karakteristik senyawa tersebut. Pemisahan senyawa dan kontaminan melalui kolom diperlukan agar senyawa murni yang diinginkan dapat dikumpulkan atau diekstrak tanpa senyawa yang tidak diinginkan (Malviya et al. 2010). Simpulan Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa fraksinasi whey protein menggunakan HPLC, ditemukan adanya 6 (enam) peak utama yang muncul secara berurutan dengan waktu retensi yang berbed dan hasil isolasi diperoleh 6 (enam) fraksi dengan tingkat kepolaran berbeda. 33