MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian Pemuliaan dan Genetik Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian telah dilaksanakan pada bulan Februari sampai Juli 2012. Sampel Materi Sampel darah yang digunakan berasal dari sapi lokal Indonesia yang terdiri atas sapi Bali, Aceh, Pesisir, PO, dan Katingan. Sampel tersebut merupakan koleksi Laboratorium Genetika Molekuler Ternak dengan jumlah seperti yang tertera pada Tabel 2 berikut. Tabel 2. Jumlah Sampel Sapi yang Digunakan No Ternak Sapi Asal n 1 Bali BIB Bali 16 2 Aceh Kab. Aceh Besar 12 3 Pesisir Kab. Pesisir Selatan 29 4 PO BIB Lembang 32 5 Katingan Kalimantan Tengah 40 Total 129 Keterangan: n = jumlah individu Bahan dan Alat Bahan yang digunakan untuk mengambil sampel adalah alkohol 70%, es batu dan kapas. Bahan yang digunakan untuk mengekstraksi DNA adalah sampel darah, Destilation Water (DW), NaCl, Proteinase-K, 1 x STE (5M NaCl, 2M tris HCl, 0,2M EDTA), SDS 10% (sodium dodesil sulfat), CIAA, ethanol absolute, ethanol 70%, phenol, dan buffer TE 80% (tris EDTA). Bahan yang digunakan untuk mengamplifikasi gen FSHR dengan teknik PCR-RFLP adalah sampel DNA, destilated water (DW), buffer, MgCl 2, pasangan primer fragmen Gen FSHR Alu-1, enzim Taq polymerase, dntp (deoxy Nucleotida Triphosfat). dan enzim restriksi
Alu-1 serta buffernya. Bahan yang digunakan adalah produk PCR, agarose, loading dye, marker 100 pb, enzim restriksi Alu-1, 0,5 x TBE, dan Ethidium Bromide (EtBr). Bahan yang digunakan untuk elektroforesis produk PCR adalah produk PCR, agarose, loading dye, marker 100pb, 0,5 x TBE, dan Ethidium Bromide. Alat yang digunakan untuk mengambil sampel adalah jarum venoject, tabung vacutainer 10 ml dan termos. Alat yang diperlukan untuk mengekstraksi DNA adalah tabung eppendorf 1,5 ml, satu set mikro pipet, tip, vortexmixer, autoclave, microsentrifuge, rotary mixer, inkubator, dan freezer. Alat yang digunakan untuk mengamplifikasi gen FSHR Alu-1 adalah satu set pipet mikro, tip pipet, mesin sentrifuse, mesin thermosycler, rak dan tabung eppendorf, dan vortex. Alat yang digunakan untuk genotyping adalah tip pipet, mikropipet 10 P Gilson, gelas kimia, gelas ukur, stirrer, microwave, gel tray, pencetak untuk sumur (comb), power supply electrophoresis 100 volt, alat foto UV trans iluminator, dan sarung tangan. Alat yang digunakan untuk elektroforesis fragmen DNA adalah tip pipet, mikropipet, gelas kimia, gelas ukur, stirrer, microwave, gel tray, pencetak untuk sumur (comb), power supply electrophoresis 100 volt, alat foto UV trans iluminator, dan sarung tangan. Prosedur Pengambilan Sampel Pengambilan sampel dilakukan pada sapi lokal Indonesia, yaitu sapi Bali, Aceh, Pesisir, PO, dan Katingan. Sampel darah diambil melalui vena jugularis (pada bagian leher sapi) dengan menggunakan jarum venoject pada tabung vaccutainer yang ditambahkan ethanol absolute dengan perbandingan 1 : 2 dan disimpan dalam lemari es hingga akan digunakan lebih lanjut. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan data sekunder yang merupakan koleksi Laboratorium Genetika Molekuler Ternak. Sampel diperoleh dari berbagai tempat di Balai Inseminasi Buatan. Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan metode yang dikemukakan oleh Sambrook et al. (1989). Pengekstraksian DNA dimulai dengan persiapan sampel terlebih dahulu. Sebanyak 200 µl sampel darah dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml dan ditambahkan 1000 µl DW (destilation water). Campuran sampel darah 10
dan DW dikocok atau divortex dan didiamkan selama lima menit, kemudian disentrifuge selama lima menit dengan kecepatan 8000 rpm. Supernatan yang terbentuk dibuang dan seperti proses sebelumnya diulangi kembali. Tahapan selanjutnya adalah degradasi protein dalam DNA. Penambahan Proteinase-K sebanyak 10 µl, 350 µl 1xSTE (sodium tris-edta) serta 40 µl 10% SDS (sodium dodesil sulfat) ke dalam tip mix. Campuran tersebut selanjutnya diinkubasi pada suhu 55 o C selama 2 jam sambil dikocok perlahan menggunakan alat pemutar. Tahapan degradasi bahan organik dilakukan dengan cara menambahkan NaCl sebanyak 40 µl 5M, larutan fenol 400 µl dan 400 µl CIAA (chloroform iso amil alcohol), lalu dikocok pelan dalam suhu ruang selama satu jam. Bagian akhir dari tahapan ekstraksi DNA adalah presipitasi DNA. Proses ini dilakukan dengan sentifugasi larutan hasil degradasi bahan organik dengan kecepatan 12.000 rpm selama lima menit sehingga terbentuk fase DNA. Sebanyak 40 µl dari fase DNA yang terbentuk diambil dan dipindahkan ke dalam tabung baru 1,5 ml. NaCl 5 M sebanyak 40 µl dan ethanol absolute sebanyak 800 µl ditambahkan, kemudian dihomogenkan dan didiamkan over night pada suhu -20 o C. Molekul DNA yang terbentuk selanjutnya dipisahkan dari ethanol absolute dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama lima menit dan supernatan yang diperoleh dibuang, kemudian ditambahkan kembali 800 µl ethanol absolute dan kembali disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama lima menit. Endapan molekul DNA diperoleh dengan cara membuang bagian supernatan yang terbentuk. Endapan tersebut kemudian didiamkan sampai kering dan disuspensikan dalam 100 µl 80% buffer TE (tris EDTA). Amplifikasi DNA Amplifikasi dilakukan menggunakan metode PCR-RFLP. 1 µl sampel DNA, 10,85 µl DW, 0,3 µl primer, 0,05 µl taq polymerase, 1,5 µl buffer, 0,3 µl dntp dan 1 µl MgCl 2 dicampurkan sebagai mix untuk mengamplifikasi DNA. Tahapan Amplifikasi invitro berlangsung sebanyak 35 siklus dengan menggunakan mesin thermocycler. Kondisi suhu yang terjadi yakni pada saat pra-denaturasi 94 o C selama lima menit, 35 siklus dengan tahapan masing-masing siklus terdiri dari denaturasi 94 o C selama 45 detik, anneling pada suhu 60 o C selama 45 detik dan ekstensi pada 11
suhu 72 o C selama satu menit. Tahap selanjutnya adalah ekstensi akhir 72 o C selama lima menit. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen FSHR Alu-1 berdasarkan Houde et al. (1994) adalah forward: 5 -CTG CCT CCC TCA AGG TGC CCC TC- 3 ; dan reverse: 5 -CCC CCT AAG ACA TTT AGC CCA GAACT-3 (Gambar 3). Forward 1 atctctgcct ccctcaaggtgcccctcatc actgtgtcca agtcaaagatcctcctggtc 61 ctgttctacc ccatcaactcctgtgccaac cccttcctct atgccatcttcaccaagaac 121 ttccgcaggg atttcttcattctgctgagc aagtttggct gctatgaagtgcaagcccag 181 AC CTataggt cagaaacctcatccactgcc cacaactttc atccaaggaacggccactgc 241 cccccag CTcccagggttactaatggttcc aattacacac ttatccccctaagacattta 301 gccaagaact aaaacacaat Reverse : primer forward : primer reverse AG CT : situs pemotongan enzim Alu-I Alel C : mempunyai basa C pada posisi basa ke 193 Alel G : mempunyai basa G pada posisi basa ke 193 Gambar 3. Posisi penempelan primer pada sekuen Posisi Penempelan Primer (cetak tebal) pada sekuen gen FSHR Alu-1 (gene bank accses code: L22319.1). Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang digunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3 yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju belum diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat (Handoyo et al., 2001). Elektroforesis Tahapan proses elektroforesis produk PCR dilakukan dengan pembuatan gel agarose 1% terlebih dahulu, dengan cara melarutkan agarose sebanyak 0,30 g dengan larutan 0,5 x TBE 30 ml. Larutan tersebut kemudian dipanaskan dalam microwave selama lima menit dan distirer dengan menambahkan 2,5 µl EtBr. Larutan yang masih cair dituangkan ke dalam cetakan gel dan sisir cetakan 12
ditempatkan di bagian tepian gel, lalu dibiarkan mengeras. Apabila gel sudah mengeras, sisir cetakan gel diangkat sehingga terbentuk sumur-sumur. Tahapan berikutnya, sebanyak 5 µl produk PCR dicampur dengan 1 µl loading dye (bromothymol blue 0,01%, xylene cyanol 0,01% dan gliserol 50%) menggunakan mikropipet dan dimasukkan masing-masing ke dalam sumur gel. 2 µl marker dicampur dengan loading dye dan diletakkan di posisi paling kiri sumur yang berfungsi sebagai penanda. Gel tersebut kemudian diletakkan ke dalam gel tray elektroforesis yang berisi larutan buffer dan dialiri listrik 100 volt sekitar 30 menit. Molekul DNA yang bermuatan negatif pada ph netral akan bergerak (bermigrasi) ke arah positif. Gel agarose diangkat setelah proses elektroforesis selesai yang ditandai dengan garis biru yang telah mendekati ambang batas sumur gel. Hasil panjang pita DNA diamati dengan menggunakan sinar ultraviolet. Tahapan ini dilakukan dengan menarik garis lurus antara posisi pita dari masing-masing sampel DNA yang ingin diukur dengan posisi pita DNA marker. Genotyping Genotyping dilakukan dengan teknik analisis Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RLFP). Tahapan awal proses ini adalah mencampurkan produk PCR sebanyak 5 µl ke dalam tabung 0,5 ml kemudian ditambahkan 0,2 µl enzim restriksi Alu-1. Mix tersebut kemudian diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 o C. Sampel DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi selama proses inkubasi dikeluarkan dari inkubator, kemudian masing-masing tip ditambahkan loading dye sebanyak 1 µl. Masing-masing sampel tersebut kemudian dielektroforesis kembali dengan tegangan 100 volt sekitar 30 menit pada gel agarose. Sampel DNA yang telah selesai dielektroforesis kemudian diangkat dan diamati panjang pita DNA yang terbentuk menggunakan sinar ultraviolet. Panjang pita yang terlihat dibandingkan dengan penanda marker untuk mengetahui panjangnya. Setiap pita DNA dari setiap sampel dibandingkan dengan marker untuk menentukan genotipe pita DNA. Satu posisi migrasi yang sama dianggap sebagai satu tipe atau alel yang bersifat homozigot. 13
Rancangan dan Analisis Data Keragaman genotipe pada masing-masing sampel dapat dilihat dari pita-pita yang ditemukan. Masing-masing sampel dianalisis menggunakan pendekatan nilai frekuensi genotipe, frekuensi alel, dan nilai heterozigositas. Frekuensi Genotipe dan Alel Frekuensi genotipe dan alel gen FSHR Alu-1dihitung berdasarkan rumus (Nei & Kumar, 2000) : Frekuensi genotipe adalah Xii = x ii = frekuensi genotipe ke-ii n ii = jumlah individu bergenotipe ii N = jumlah individu sampel Frekuensi alel adalah Xi = x i = frekuensi alel ke-i n ii = jumlah individu bergenotipe ii n ij = jumlah individu bergenotipe ij N = jumlah individu sampel Heterozigositas Pendugaan nilai heterozigositas pengamatan (H o ) dan heterozigositas harapan (H e ) dihitung menggunakan rumus Weir (1996) : H o = heterozigositas pengamatan (populasi) n ij = jumlah individu heterozigot N = jumlah individu yang diamati H e = nilai heterozigositas harapan x i = frekuensi alel q = jumlah alel 14