BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian eksperimental tanpa adanya pengukuran awal (pretest) tetapi hanya pengukuran akhir (post test) / post-test only control group design B. Tempat 1. Tempat pemeliharaan dan induksi hewan dilakukan di Unit Pemeliharaan Hewan Coba Laboratorium Histologis Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret. 2. Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret untuk pemeriksaan ELISA. 3. Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret untuk pemeriksaan dan pembuatan preparat imunohistokimia. C. Subjek penelitian dan Besar Sampel Subjek penelitian adalah mencit betina sub spesies Mus musculus galur Balb/C dari satu induk yang sama, umur 3-4 bulan, berat badan 20 30 gram, diperoleh dari Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada. Bahan makanan mencit digunakan pakan mencit standar BR I. Pemilihan hewan coba mencit berdasarkan pertimbangan bahwa mencit Mus musculus paling sering dipakai pada penelitian biomedik, karena secara genetik mempunyai kemiripan dengan manusia, dan mempunyai kemampuan beradaptasi dalam lingkungan laboratorium Pristan adalah zat kimiawi (2,6,10,14-Tetramethyl pentadecane/ TMPD) suatu alkana isoprenoid yang biasa digunakan untuk induksi hewan coba model nefritis lupus (Reeves, 2012). Diberikan secara intraperitoneal dengan injeksi dosis tunggal 0,5 ml. Penelitian eksperimental ini dilakukan pada populasi (N) tidak diketahui. Rumus yang dipakai untuk menentukan besar sampel (n) adalah: n = (Z ½α+Zβ ) (Steel dan Torrie, 1980)
Karena 2 sulit ditaksir dari literatur, studi yang sama sebelumnya belum ada atau studi pendahuluan oleh peneliti, maka diasumsikan 2 2, sehingga hasilnya n= (Z½ + Z ) 2 n = (1,645 + 0,842) 2 = 6,185 dibulatkan menjadi 7. Keterangan: n = besar sampel masing-masing kelompok. Z½ = nilai standar normal, yang besarnya tergantung. Bila = 0,05 Z½ = 1,645. Z = nilainya tergantung yang ditentukan (berdasarkan tabel). = error untuk menerima H 0, bila H 0 salah. Bila = 0,08 Z = 0,842 = selisih antara rerata variabel terapi dan kontrol yang diharapkan oleh peneliti = standar deviasi Berdasar rumus didapatkan jumlah sampel minimal adalah tujuh ekor. Dalam penelitian ini digunakan tujuh ekor mencit untuk setiap kelompok observasinya, sehingga telah memenuhi batas minimal sampel. D. Identifikasi Variabel 1. Variabel tergantung: a. IL-6 b. Mikroalbuminuria 2. Variabel bebas: Secretome E. Definisi Operasional Tabel 3. Definisi Operasional Variabel Parameter Definisi Alat Ukur Satuan Data Skala Data IL-6 Adalah protein pleitropik dengan Skor Sel Rasio berat 26 kda yang diperoleh dari gambaran Patologi Anatomi hasil pengecatan imunohistokimia dari jaringan ginjal. histologis reaktif/ 100 sel makrof ag mikroalbu minuria Adalah albumin sebanyak 20-200 µg urine ditampung dari uretra mencit. ELISA µg/ml Rasio
Secretome Adalah hasil sekresi dari sel punca mesenkimal Amnion placenta manusia yang diperoleh dari PT Dermama. Dosis yang diberikan 0,45 ml intraperitoneal. Pipet ml ml nomin al F. Waktu Waktu yang diperlukan dalam penelitian ini selama 5 bulan dengan jadwal penelitian sebagai berikut. Jenis Kegiatan 1) Persiapan : memesan bahanbahan, mengumpulkan kepustakaan, diskusi, membuat log book 2) Pelaksanaan Penelitian: Induksi hewan coba model lupus, pemeriksaan IL-6, pemeriksaan mikroalbuminuria, pembuatan dan interpretasi imunohistokimia dan analisis data 3) Penyusunan Laporan Penelitian Bulan ke- 1 2 3 4 5 Gambar 9. Jadwal penelitian G. Cara Kerja Sampel mencit Balb/C betina usia 3-4 bulan berat badan 20-30 gram diambil sebanyak 21 ekor secara acak dengan metode simple random sampling kemudian dibagi menjadi tiga kelompok yaitu kelompok kontrol, kelompok perlakuan dengan injeksi pristan dosis tunggal 0,5 ml intraperitoneal, dan kelompok terapi yang diberi injeksi
intraperitoneal pristan dosis tunggal 0,5 ml dan secretome sel punca mesenkimal 0,45 ml dosis tunggal. 1. Perlakuan: a. Kelompok kontrol: diberikan injeksi Nacl 0,9% 0,5 ml (placebo) + injeksi Nacl 0,9% 0,45 ml (placebo) b. Kelompok pristan : injeksi pristan 0,5 ml intraperitoneal + injeksi Nacl 0,9% 0,45 ml (placebo) c. Kelompok pristan + secretome : injeksi intraperitoneal pristan 0,5 ml dan secretome sel punca mesenkimal 0,45 ml intraperitoneal 2. Secretome diperoleh dari PT Dermama 3. Teknik pengambilan sampel dan penanganan spesimen: a. Pemeriksaan IL-6 dan mikroalbuminuria dilakukan sesudah perlakuan. b. Dilakukan pemeriksaan imunohistokimia untuk pemeriksaan IL-6 dan penampungan urin untuk pemeriksaan kadar mikroalbuminuria. 4. Prinsip pemeriksaan IL-6 (Metode imunohistokimia) : Ekspresi IL-6 penilaian positifitas pemeriksaan imunohistokimia dengan menggunakan antibodi monoklonal terhadap IL-6. Cara ukur dinilai secara kuantitatif, visual dengan mikroskop cahaya pembesaran 400x terhadap 100 sel makrofag sebagai sel yang mengekspresikan IL-6. Kemudian dihitung jumlah sel-sel tersebut yang imunoreaktif tercat coklat perak, pada membran sel. Jumlah semua sel immunoreaktif yang ditemukan kemudian dijumlahkan dan selanjutnya dimasukkan sebagai data (bilangan dalam tabel untuk tiap hewan coba) (Tomino, 2000; Susilo, 2006). 5. Teknik pewarnaan imunohistokimia. Teknik pewarnaan imunohistokimia adalah pewarnaan imuno-peroksidase indirek dengan metode avidin biotin complex (ABC) tiga fase dengan tahapan sebagai berikut: a. Dilakukan deparafinisasi sayatan jaringan untuk menghilangkan parafin dari jaringan. Deparafinisasi dilakukan dengan cara standar baku laboratorium, yaitu secara bertahap dengan waktu tertentu memasukkan preparat kedalam cairan aseton, xylol, alkohol 100%, alkohol 90%, alkohol 80%, alkohol 70% dan air. b. Cuci jaringan dengan PBS ph 7,4.
c. Inkubasi jaringan dengan tripsin 0,125 % pada temperatur 37 0 C selama 5-10 menit, untuk membuka masking antigen. d. Jaringan diinkubasikan dengan H 2 0 2 0,5% dalam metanol selama 30 menit untuk menghilangkan pewarnaan endogen, dibiarkan pada temperatur ruangan. e. Cuci dengan air mengalir selama 1 menit, diikuti pencucian dengan akuadestilata. f. Tandai jaringan dan cuci dengan PBS ph 7,4 selama 5 menit. g. Inkubasi dengan 3% serum yang dilarutkan dalam BSA 1% selama 20 menit. h. Cuci dengan PBS ph 7,4 sebanyak dua kali, masing-masing selama 3 menit. i. Jaringan diinkubasi dengan monoklonal antibodi primer yaitu murine monoclonal antibody terhadap molekul (IL-6) dari mice (Santa Cruz, US). Monoklonal antibodi dilarutkan dengan TRIS-PBS 1:200. Untuk jaringan seluas 1 cm 2 diperlukan 100 L monoklonal antibodi. Inkubasi dilakukan selama 30 menit dalam ruang lembab. j. Cuci jaringan dengan PBS ph 7,4 dua kali masing-masing selama 3 menit. k. Inkubasi jaringan dengan antibodi primer yaitu antibodi anti murine yang telah dibiotinilisasi (Dako Kit). Lama inkubasi 30 menit. l. Cuci jaringan dengan PBS ph 7,4 dua kali masing-masing selama 3 menit. m. Inkubasi jaringan dengan streptavidin-biotin peroksidase (Dako Kit) selama 30 menit. n. Cuci jaringan dengan PBS ph 7,4 dua kali masing-masing selama 3 menit. o. Inkubasi jaringan dengan substrat (Dako Kit) sampai timbul warna coklat pada jaringan, selama ± 15 menit. p. Cuci jaringan dengan PBS ph 7,4 dua kali masing-masing selama 3 menit. q. Warnai jaringan dengan Hematoksilin. r. Cuci jaringan dengan air mengalir. s. Tutup jaringan dengan kaca penutup (deck glass) dan lem dengan entelan. t. Prosedur pembacaan preparat Pengamatan dilaksanakan dengan mikroskop cahaya dalam skala pembesaran 400x. Dipilih lapang pandang yang paling banyak area positifnya, selanjutnya dihitung (dilakukan cropping) jumlah area positif pada lima lapangan pandang searah jarum jam. Dengan mikroskop OLYMPUS seri BX 41 yang dilengkapi dengan kamera DP-70 dan memakai software OLYSIA, intensitas warna dan area IL-6 dapat diketahui. Tingkat ekspresi ditentukan secara kuantitatif sebagai nilai rata-rata pengamatan. Masing-masing sediaan diteliti sebanyak lima lapang pandang dan nilai dari setiap
lapang pandang akan dihitung sebagai nilai skor histologis untuk memperoleh ekspresi IL-6 secara kuantitas. u. Sistem perhitungan skor histologis adalah sebagai berikut: Penelitian skor histologis adalah IL-6 berdasarkan presentasi dan intensitas. Jika presentasi : 0 : Tidak ada area positif 1 : area positif 1-25% 2 : area positif 26-50% 3 : area positif 51-75% 4 : area positif 76-100% Intensitas : 0 : tidak terwarnai/ negative 1 : positif lemah 2 : positif sedang 3 : positif kuat Nilai ekspresi IL-6 ditentukan dengan rumus sebagai berikut Skor = (IK x PK) + (IS X PS) + (ILXPL)+(INXPN) I = Intensitas P = Persentase (Luas Area dalam µm2) K = kuat S = sedang L = lemah N = negative Skor dari kelima lapang pandang kemudian dirata-rata untuk menentukan nilai ekspresi secara kuantitatif dari sediaan tersebut. (Tomino, 2000). 1. Teknik pemeriksaan mikroalbuminuria. Alat dan bahan dalam penelitian ini yaitu untuk pemeriksaan mikroalbuminuria digunakan alat : pot penampun urin, tabung reaksi dan bahan : urin dan dikur diukur dengan ELISA. Penelitian ini dilakukan dengan memeriksa kadar mikroalbuminuria yaitu dengan cara disiapkan sampel urin spot pagi hari, kemudian. Cara yang digunakan sebagai berikut: a. Sample urin disimpan dalan tabung top microsentrifuge. b. Disentrufuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 3 menit.
c. Tambahkan 1-50 µ urine supernatan, letakkan pada kollum mcrotier plate sesuai urutan yang tertulis.. d. Tambahkan PBS sampai volume 50 µl. e. Encerkan sampel urin dengan perbandingan 1:2 f. Tambahkan 250 µl 0,1 N Hcl pada c g. kolum yang kosong sesuai petunjuk dan 250 µl sulfosalisilat pada kolum kosong yang ditentukan. h. Diamkan plate selama 10 menit pada suhu ruangan. i. Dilakukan pembacaan dengan ELISA. H. Teknik Analisis Data Data disajikan dalam bentuk mean ± SD kemudian dianalisis menggunakan SPSS 22 for windows dengan nilai p <0,05 dianggap signifikan secara statistik. Untuk mengetahui beda rata-rata antara kelompok kontrol, pristan dan media terkondisi sel punca mesenkimal, digunakan uji F Anova bila distribusi data normal dan bila signifikan akan dilanjutkan dengan LSD Post Hoc Test. Sedangkan bila datanya tidak normal digunakan uji Kruskal-Wallis yang akan dilanjutkan dengan Mann whitney. I. Alur Penelitian 21 ekor mencit Balb/C betina Umur 3-4 bulan, Berat badan ± 20-30 gr Randomisasi Kelompok kontrol 7 ekor Kelompok pristan 7 ekor Kelompok pristan + secretome 7 ekor Injeksi Nacl 0,9% 0,5 ml Single injeksi Pristan 0,5 ml intraperitoneal 3-5 minggu Injeksi Nacl 0,9% 0,45 ml i.p Secretome 0,45 ml ip 3 hari Sampel ginjal dan urin Pemeriksaan imunohistokimia IL -6 dan mikroalbuminuria Analisis data
Gambar 10. Alur penelitian