BAB IV HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN

BAB IV HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN 4.1 Determinasi Tanaman Berdasarkan determinasi di Herbarium Bandungense Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung, dinyatakan bahwa daun yang diperoleh dari Perkebunan bibit Cihideung, Bandung adalah Carica papaya Linn. 4.2 Ekstraksi Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi adalah etanol-air (1:3). Penggunaan pelarut tersebut berdasarkan kelarutan papain dan karpain yang diperkirakan sebagai komponen aktif. Rendemen yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 4.1. Proses ekstraksi serbuk simplisia daun pepaya dilakukan dengan cara maserasi. Hal ini dilakukan berdasarkan stabilita papain yang dapat terdegradasi pada suhu lebih tinggi dari 60 o C. Pemekatan ekstrak dilakukan dengan menggunakan penguap vakum berputar (rotavapor) sampai diperoleh ekstrak kental. Selanjutnya, ekstrak kental tersebut diuapkan dengan menggunakan oven vakum suhu 38 ± 2 o C, sampai mencapai bobot tetap, mengacu pada stabilita papain yang dapat terdegradasi pada suhu lebih tinggi dari 60 o C. Tabel 4.1 Rendemen Daun pepaya basah Serbuk simplisia Ekstrak Rendemen (% b/ b) Berat (g) 6740 1537-22,80-1300 341,98 26,30 39

40 4.3 Karakterisasi Mutu Simplisia dan Ekstrak Karakterisasi mutu serbuk simplisia dan ekstrak meliputi pemeriksaan secara makroskopik, pemeriksaan kandungan, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut air, penetapan kadar sari larut etanol. Khusus terhadap ekstrak juga dilakukan penentuan pola kromatogram, penentuan bobot jenis, penentuan ph, penentuan angka kapang, dan angka lempeng total. 4.3.1 Pemeriksaan Makroskopik Pemeriksaan makroskopik simplisia dan ekstrak dilakukan dengan mengamati warna, bau, adanya lendir, cendawan serta pengotor lainnya, ukuran partikel, dan konsistensi. Hasil pemeriksaan makroskopik dapat dilihat pada Tabel 4.2. Tabel 4.2 Hasil Pemeriksaan Karakteristik Simplisia dan Ekstrak secara Makroskopik No. Parameter Simplisia Ekstrak 1. Warna Hijau Coklat tua 2. Bau Khas Khas 3. Mikroorganisme x x 4. Ukuran partikel 20 mesh - 5. Konsistensi Serbuk Kental Keterangan : x = tidak terdapat pertumbuhan mikroba, cendawan 4.3.2 Penetapan Kadar Air, Kadar Sari Larut Air, Kadar Sari Larut Etanol Simplisia dan Ekstrak serta Penentuan ph dan Bobot Jenis Ekstrak Hasil penetapan kadar air, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol simplisia dan ekstrak memberikan data spesifikasi simplisia dan ekstrak. Data spesifikasi simplisia dan ekstrak dapat dilihat pada Tabel 4.3. Tabel 4.3 Spesifikasi Simplisia dan Ekstrak No. Parameter Simplisia Ekstrak 1. Kadar air 7,99 % v/b 15,22 % v/b 2. Kadar sari larut dalam air 5,64 % b/b 16,16 % b/b 3. Kadar sari larut dalam etanol 1,75 % b/b 0,64 % b/b 4. ph - 5,16 5. Bobot Jenis - 1,31 g/ml

41 Hasil penetapan kadar air simplisia adalah 7,99 % v/b. Menurut Materia Medika Indonesia, kadar air simplisia tidak lebih dari 10 % v/b. Hal ini dimaksudkan untuk menghambat atau mencegah pertumbuhan mikroba pada simplisia. Persentase kadar sari larut air yang lebih tinggi daripada kadar sari larut etanol menunjukkan bahwa pada serbuk simplisia dan ekstrak daun pepaya terdapat lebih banyak senyawa yang terlarut dalam air daripada senyawa yang terlarut dalam etanol. Oleh karena ph ekstrak cukup asam, maka perlu dipilih basis gel yang cocok pada rentang ph tersebut sehingga tercapai stabilitas sediaan yang cukup baik. 4.3.3 Penapisan Fitokimia Simplisia dan Ekstrak Hasil penapisan fitokimia simplisia dan ekstrak daun pepaya menunjukkan hasil yang positif pada golongan alkaloid dan steroid/triterpenoid (Tabel 4.4). Karpain (suatu alkaloid) dan terpenoid yang terkandung dalam pepaya mempunyai efek antimikroba (3) (Cowan, 1999). Tabel 4.4 Hasil Penapisan Fitokimia Golongan Senyawa Simplisia Ekstrak 1. Alkaloid + + 2. Tanin - - a) Tanin Galat - - b) Tanin Katekat - - 3. Flavonoid - - 4. Steroid / Triterpenoid + + 5. Kuinon - - 6. Saponin - - Keterangan (+) = positif mengandung golongan senyawa tersebut (-) = negatif tidak mengandung golongan senyawa tersebut (3) Jozef, F., 2005, The Chemical Anthropology of Antimicrobial Plants, Skadi.net [Serial Online], http://forum.skadi.net/showthread.php?p=353823 [7 Oktober 2006].

42 4.3.4 Penentuan Pola Kromatogram Gambar pola kromatogram terlihat pada gambar di bawah ini. E P E P E P E P E P E P 1a 1b 1c 2a 2b 2c Gambar 4.1 Pola kromatogram KLT ekstrak daun pepaya terhadap papain dengan fase diam silika gel GF 254, pengembang kloroformmetanol-nh 3 30 %-etil asetat (2:2:1:2), E = Ekstrak daun pepaya, P = papain, 1 = tanpa penampak bercak, 2 = dengan penampak bercak H 2 SO 4 10 %, a = visibel, b = sinar UV λ 254 nm, c = sinar UV λ 366 nm E E E E E E 1a 1b 1c 2a 2b 2c Gambar 4.2 Pola kromatogram KLT ekstrak daun pepaya terhadap papain dengan fase diam silika gel GF 254, pengembang kloroformmetanol-nh 3 30 %-etil asetat (2:2:1:2), E = Ekstrak daun pepaya, P = papain, 1 = tanpa penampak bercak, 2 = dengan penampak bercak Dragendorff, a = visibel, b = sinar UV λ 254 nm, c = sinar UV λ 366 nm

43 E P E E P P E P E P E P 1a 1b 1c 2a 2b 2c Gambar 4.3 Pola kromatogram KLT ekstrak daun pepaya terhadap papain dengan fase diam silika gel GF 254, pengembang kloroformmetanol-nh 3 30 % (2:2:1), E = Ekstrak daun pepaya, P = papain, 1 = tanpa penampak bercak, 2 = dengan penampak bercak ninhidrin 0,2 %, a = visibel, b = sinar UV λ 254 nm, c = sinar UV λ 366 nm Kromatogram ekstrak dan papain dengan penampak bercak ninhidrin 0,2 % memberikan beberapa bercak dengan warna merah hingga ungu (visibel) yang menunjukkan adanya asam amino dan peptida (Kibardin and Lazurkins, 1969; Allen, 1989). Bercak pada kromatogram ekstrak yang berwarna merah ungu mempunyai kesamaan dengan bercak merah ungu pada kromatogram papain, menunjukkan bahwa di dalam ekstrak terdapat kandungan papain. Kromatogram ekstrak dengan penampak bercak Dragendorff memberikan empat bercak dengan warna merah jingga hingga merah bata (visibel) yang menunjukkan adanya senyawa alkaloid yang terkandung dalam ekstrak. 4.3.5 Penentuan ALT dan Angka Kapang Ekstrak Bahan baku tanaman yang akan digunakan sebagai sediaan topikal, mempunyai batas angka bakteri 10 7 cfu/g dan angka kapang 10 4 cfu/g (Handa, 2005; WHO, 1998). Hasil penentuan angka kapang dan angka lempeng total ekstrak dapat dilihat pada Gambar 4.4 dan Tabel 4.5.

44 Tabel 4.5 Penentuan Angka Lempeng Total Ekstrak dan Angka Kapang pada Ekstrak No. Parameter Jumlah koloni pada ekstrak (cfu/ml) 1. Angka lempeng total (ALT) 7,60. 10 5 2. Angka kapang 3,79. 10 5 (a.) (b.) Gambar 4.4 Keterangan : Angka kapang dan ALT ekstrak (a.) = Angka kapang, (b.) = Angka lempeng total (ALT) Sebagai bahan baku, ekstrak mempunyai angka kapang lebih besar dari 10 4 cfu/g, menunjukkan bahwa ekstrak berpotensi untuk menjadi media pertumbuhan kapang. Hal ini terjadi karena adanya kandungan steroid / lemak-lemak / minyak dan air dalam ekstrak dapat menjadi nutrisi bagi mikroorganisme. Oleh karena itu, formulasi memerlukan penambahan pengawet yang bersifat bakteriostatik sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri dan kapang dalam ekstrak. 4.4 Penyiapan Biakan Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes Untuk uji potensi gel ekstrak, Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes dibuat biakan Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes sebesar masingmasing 8,65.10 9 cfu/ml dan 2,7.10 7 cfu/ml. Untuk Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes, masing-masing biakan tersebut setara dengan transmisi 27 % dan transmisi 60,8 % dengan spektronic pada panjang gelombang 580 nm.

45 4.5 Penentuan KHM Penentuan nilai KHM dari ekstrak daun pepaya dan papain dilakukan terhadap Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes. Penentuan KHM ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri dari ekstrak daun pepaya terhadap Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes, seperti yang terlihat pada gambar 4.5 dan 4.6. Gambar 4.5 Keterangan : Diameter zona hambat ekstrak daun pepaya terhadap Staphylococcus epidermidis E = ekstrak, 0.5, 1, 3, 5, 7, 10, 13, 15, 21, 25, 35, 50, 75 = Ekstrak (% b/v) dalam etanol air 1: 3 Gambar 4.6 Keterangan : Diameter zona hambat ekstrak daun pepaya terhadap Propionibacterium acnes E = ekstrak, 0.5, 1, 3, 5, 7, 10, 15, 21, 25, 35, 50, 75 = Ekstrak (%b/v) dalam etanol air 1: 3

46 Tabel 4.6 Aktivitas Ekstrak Daun Pepaya terhadap Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes Konsentrasi Diameter zona hambat (mm) terhadap (% b/v) Staphylococcus epidermidis Propionibacterium acnes 0,5 - - 1 - - 3 - - 5 - - 7 15,75 ± 0,07-10 17,35 ± 0,35-13 18,65 ± 0,49-15 19,75 ± 0,07-21 20,25 ± 0,07-25 21,50 ± 0,14-35 22,55 ± 0,07-50 23,65 ± 0,07-75 26,45 ± 4,74 - z Keterangan : (-) = tidak menunjukkan adanya zona hambat Sebagai kontrol positif, digunakan tetrasiklin yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes. Sedangkan sebagai kontrol negatif, digunakan media yang diinokulasikan dengan bakteri Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes tanpa zat uji, yang menunjukkan bahwa media tersebut dapat menjadi media pertumbuhan masing-masing bakteri tersebut. Hasil penentuan KHM ekstrak daun pepaya terhadap Staphylococcus epidermidis menunjukkan bahwa konsentrasi minimum yang masih memberikan zona hambat adalah 7 % b/v, sedangkan hasil penentuan KHM ekstrak daun pepaya terhadap Propionibacterium acnes tidak menunjukkan adanya zona hambat, seperti terlihat pada Tabel 4.6. Hal ini berarti ekstrak daun pepaya lebih efektif terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis tetapi tidak dapat menghambat / tidak efektif terhadap Propionibacterium acnes.

47 Berdasarkan hasil penelitian, papain tidak menunjukkan zona hambat baik terhadap Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes. Hal ini berarti papain tidak bertindak sebagai senyawa aktif dalam ekstrak daun pepaya yang berkhasiat sebagai antibakteri. Hal ini berarti aktivitas antibakteri ekstrak daun pepaya kemungkinan berasal dari senyawa lain yang terkandung di dalamnya. Sesuai dengan pustaka, diduga senyawa tersebut adalah karpain (alkaloid) dan terpenoid. Gambar 4.7 Keterangan : Diameter zona hambat papain terhadap Staphylococcus epidermidis P = papain, 0.5, 1, 3, 5, 7, 10, 15, 21, 25, 35, 50, 75 = papain (% b/v) dalam etanol air 1: 3 Gambar 4.8 Keterangan : Diameter zona hambat papain terhadap Propionibacterium acnes P = papain, 0.5, 1, 3, 5, 7, 10, 15, 21, 25, 35, 50, 75 = papain (% b/v) dalam etanol air 1: 3

48 Tabel 4.7 Aktivitas Papain terhadap Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes Konsentrasi Diameter zona hambat (cm) terhadap (% b/v) Staphylococcus epidermidis Propionibacterium acnes 0,5 - - 1 - - 3 - - 5 - - 7 - - 10 - - 15 - - 21 - - 25 - - 35 - - 50 - - 75 - - Keterangan : (-) = tidak menunjukkan adanya zona hambat 4.6 Penentuan Kesetaraan Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun Pepaya dan Tetrasiklin Hidroklorida terhadap Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes Tetrasiklin mempunyai spektrum antibakteri yang luas meliputi kuman gram-positif dan negatif, aerobik dan anaerobik,serta aktif juga terhadap spiroket, mikoplasma, riketsia, klamidia, legionela, dan protozoa tertentu. Tetrasiklin menghambat sintesis protein bakteri pada ribosomnya dengan menghalangi pelekatan trna-aminoasil yang bermuatan, sehingga tetrasiklin menghalangi penambahan asam amino baru pada rantai peptida yang sedang terbentuk. Gambar 4.9 Struktur tetrasiklin

49 Berdasarkan nilai KHM seperti pada Tabel 4.6 kemudian dilakukan penentuan kesetaraan aktivitas antibakteri antara ekstrak daun pepaya dan antibiotik tetrasiklin hidroklorida terhadap Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes, seperti terlihat pada gambar 4.10 dan 4.11. Gambar 4.10 Keterangan : Diameter zona hambat tetrasiklin terhadap Staphylococcus epidermidis T = tetrasiklin, 1.10-3 ; 5.10-3 ; 0,1; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5;10 = tetrasiklin (% b/v) dalam dapar HCl 0,1 N

50 Gambar 4.11 Keterangan : Diameter zona hambat tetrasiklin terhadap Propionibacterium acnes T = tetrasiklin, 1.10-6 ; 5.10-6 ; 1.10-5 ; 5.10-5 ; 1.10-4 ; 5.10-4 ; 1.10-3 ; 5.10-3 ; 0,1; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5;10 = tetrasiklin (% b/v) dalam dapar HCl 0,1 N

51 Tabel 4.8 Penentuan KHM Tetrasiklin Hidroklorida terhadap Staphylococcus epidermidis dan Propionibacterium acnes Konsentrasi Diameter zona hambat (mm) terhadap (% b/v) Staphylococcus epidermidis Propionibacterium acnes 1.10-6 - 9,05 ± 0,07 1.10-5 - 10,50 ± 0,57 1.10-4 - 13,10 ± 0,71 1.10-3 - 16,10 ± 0,31 1.10-1 10,13 ± 0,25 23,00 ± 0,20 5.10-1 12,30 ± 0,44 24,85 ± 0,15 1,0 14,10 ± 0,30 26,15 ± 0,17 1,5 15,23 ± 0,49 28,50 ± 0,25 2,0 16,17 ± 0,31 30,20 ± 0,26 2,5 17,17 ± 0,21 32,15 ± 0,15 3,0 17,82 ± 0,49 33,30 ± 0,31 3,5 18,10 ± 0,20 34,70 ± 0,12 4,0 18,37 ± 0,42 36,90 ± 0,17 4,5 19,13 ± 0,15 38,70 ± 0,12 5,0 19,73 ± 0,21 40,10 ± 0,10 5,5 21,23 ± 0,25 41,95 ± 0,15 6,0 21,87 ± 0,15 43,05 ± 0,15 6,5 22,73 ± 0,21 44,45± 0,15 7,0 24,03 ± 0,15 45,10± 0,06 7,5 25,00 ± 0,10 45,75 ± 0,15 8,0 25,97 ± 0,12 46,10 ± 0,10 8,5 27,10 ± 0,10 46,70 ± 0,12 9,0 29,10 ± 0,10 47,40 ± 0,12 9,5 30,17 ± 0,31 47,80 ± 0,06 10 31,17 ± 0,21 48,10 ± 0,25 Keterangan : (-) = tidak menunjukkan adanya zona hambat

52 Aktivitas antibakteri tetrasiklin hidroklorida dapat dilihat pada kurva diameter zona hambat tetrasiklin hidroklorida terhadap konsentrasi tetrasiklin hidroklorida (gambar 4.12 dan 4.13). Diameter zona hambat (mm) 35 30 25 20 15 10 5 0 y = 1.8743x + 11.411 R 2 = 0.9804 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Konsentrasi (% b/v) Gambar 4. 12 Keterangan : Kurva aktivitas antibakteri tetrasiklin hidroklorida terhadap Staphylococcus epidermidis dengan persamaan garis Y = 1,8743x + 11,411dan r = 0,990152 Diameter zona hambat (mm) 60 50 40 30 20 10 0 y = 3.0635x + 23.904 R 2 = 0.9851 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Konsentrasi (% b/v) Gambar 4. 13 Kurva aktivitas antibakteri tetrasiklin hidroklorida terhadap Propionibacterium acnes dengan persamaan garis Y = 3,0635x + 23,904 dan r = 0,992522

53 Hasil regresi dari kurva aktivitas antibakteri tetrasiklin hidroklorida terhadap Staphylococcus epidermidis (r = 0,99) dan Propionibacterium acnes (r = 0,99) hampir linear (r 1), sehingga dapat disimpulkan bahwa aktivitas tetrasiklin berbanding lurus dengan bertambahnya konsentrasi tetrasiklin. Tetrasiklin hidroklorida yang beredar di pasaran adalah tetrasiklin hidroklorida dengan konsentrasi 3 % b/v. Berdasarkan penelitian, Tetrasiklin hidroklorida 3 % b/v tersebut menunjukkan diameter zona hambat sebesar 17,82 ± 0,49 mm dan setara dengan diameter zona hambat ekstrak daun pepaya konsentrasi 10-13 % b/v. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa aktivitas antibakteri tetrasiklin hidroklorida 3 % b/v setara dengan aktivitas antibakteri ekstrak daun pepaya konsentrasi 10-13 % b/v. Pada pengembangan formulasi gel ekstrak daun pepaya digunakan konsentrasi 21 % b/v, yaitu setara dengan 3 kali nilai KHM ekstrak daun pepaya terhadap Staphylococcus epidermidis. Penggunaan konsentrasi sebesar tiga kali KHM dimaksudkan untuk antisipasi kehilangan sebagian kosentrasi pada proses pembuatan gel dan memperhitungkan adanya afinitas ekstrak daun pepaya terhadap basis gel yang menyebabkan turunnya aktivitas ekstrak jika sudah dalam bentuk sediaan gel. Aktivitas gel ekstrak diharapkan setara atau tidak kurang dari daya hambat gel tetrasiklin 3 % b/v, seperti terlihat pada hasil orientasi konsentrasi / dosis ekstrak daun pepaya untuk pengembangan gel (gambar 4.14 dan Tabel 4.9). Gambar 4. 14 Keterangan : (a.) Diameter zona hambat gel ekstrak daun pepaya dengan berbagai konsentrasi terhadap Staphylococcus epidermidis (a.) = dengan basis HPC-LV, (b) = dengan basis HPMC, 1 = 1 kali KHM (7 %b/v ekstrak), 2 = 2 kali KHM (14 %b/v ekstrak), 2,5 = 2,5 kali KHM (17,5 %b/v ekstrak), 3 = 3 kali KHM (21 %b/v ekstrak) (b)

54 Tabel 4.9 Aktivitas Antibakteri Sediaan Gel Ekstrak Daun Pepaya dengan Berbagai Konsentrasi terhadap Staphylococcus epidermidis Konsentrasi Ekstrak Daun Pepaya Diameter zona hambat (mm) dengan Basis HPC-LV dengan Basis HPMC 1 KHM ( 7 % b/v) 12,65 ± 0,49 10,95 ± 0,92 2 KHM (14 % b/v) 13,60 ± 0,57 11,95 ± 0,49 2,5 KHM (17,5 % b/v) 15,35 ± 0,07 12,75 ± 0,64 3 KHM (21 % b/v) 19,80 ± 0,30 15,27 ± 0,25 4.7 Orientasi Komposisi Basis Gel Orientasi basis gel dilakukan menggunakan basis Karbopol 934, HPMC, dan HPC-LV. Pemilihan ketiga jenis basis ini berdasarkan pada sifat fisikokimia pembentuk gel dan komposisi senyawa daun pepaya, meliputi ph dan kelarutan. Selain itu, sifat polimer Karbopol 934, HPMC, dan HPC-LV memiliki daya adhesi yang relatif kuat pada kulit, sehingga akan meningkatkan waktu kontak antara sediaan dan kulit. Karbopol 934, HPMC, dan HPC-LV merupakan polimer yang larut air dan jumlah air yang banyak akan menghidrasi stratum corneum, sehingga terjadi perubahan permeabilitas stratum corneum menjadi lebih permeable terhadap zat aktif yang dapat meningkatkan permeasi zat aktif. Komposisi masing-masing basis gel dapat dilihat pada tabel 4.10. Tabel 4.10a Orientasi Komposisi Basis Gel Bahan Formula F 1 F 2 F 3 F 4 F 5 F 6 F 7 F 8 F 9 F 10 F 11 F 12 F 13 Carbopol 934 (% b/v) 0,25 0,4 0,5 1,0 1,5 - - - - - - - - TEA (% v/v) 0,35 0,7 0,85 2,125 2,72 5 - - - - - - - - HPMC (% b/v) - - - - - 1,0 1,5 1,75 2,0 2,25 2,5 3,0 5,0 Aquadest ad 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 ph 6.64 6.46 6.49 6.46 6.49 6.66 6.33 6.47 6.26 6.18 6.15 6.2 6.25 Viskositas (cp) 5400 52400 80067 705000-92.5 2675 4960 7135 21800 69050 59850 - Bau k k k K k k k k k k k k k Fisik c a. kk a. kk Kk kk c a. ktl a. ktl ktl ktl ktl ktl s. ktl t, t, Warna t T t t t t t t t t t a. kr a. kr Keterangan : k = khas, c = cair, a. kk = agak kaku, kk = kaku, a. ktl = agak kental, s. ktl = sangat kental, ktl = kental, t = transparan, a. kr = agak keruh

55 Gel ekstrak daun pepaya kemudian dibuat dengan basis Karbopol 934 0,5 % dan HPMC 2 %. Namun, ternyata ekstrak daun pepaya merusak basis Karbopol sehingga viskositas menjadi sangat encer. Hal ini disebabkan karena Karbopol mempunyai ph netral/basa, sedangkan ph ekstrak daun pepaya adalah 5,16. Viskositas paling maksimum gel carbopol terjadi pada ph 6-11, viskositas menurun pada ph < 3 dan > 12. Oleh karena itu, jika dicampurkan viskositas menurun karena ikatan sambung silang pada gel menjadi rusak / putus, maka dapat disimpulkan bahwa basis carbopol tidak sesuai untuk sifat fisikokimia ekstrak daun pepaya. Gel ekstrak daun pepaya dengan basis HPMC 2 % mempunyai viskositas yang rendah, sehingga basis gel perlu dioptimasi kembali sehingga memperoleh viskositas yang diinginkan. Hal ini disebabkan oleh kelarutan HPMC yang tidak larut dalam etanol, tetapi larut dalam etanol-air, sehingga perlu dioptimasi dengan mendispersikan HPMC dalam airetanol dan juga basis HPC-LV yang memiliki kelarutan lebih baik dalam etanol serta untuk menghindari ketidakhomogenan basis dengan ekstrak daun pepaya yang merupakan ekstrak etanol-air (1:3). Tabel 4.10b Orientasi Komposisi Basis Gel Bahan Formula B 3 M B 5 M B 5 C B 10 C B 15 C B 30 C HPC-LV (% b/v) - - 5 10 15 30 HPMC (% b/v) 3 5 - - - - Etanol air (1 : 3) ad 100 100 100 100 100 100 Bau Khas Khas Khas Khas Khas Khas Fisik Kental Sangat kental sangat encer Encer agak kental Kental Warna Transparan Transparan Transparan transparan Transparan, agak kekuningan Transparan, agak kekuningan Keterangan : B = Basis Selanjutnya, dilakukan pengamatan secara organoleptik terhadap masing-masing basis gel tersebut dan akhirnya dipilih satu konsentrasi zat pembentuk gel yang paling baik secara organoleptik, yaitu basis gel B 5M dan B 30C disesuaikan dengan konsistensi gel untuk penambahan konsentrasi ekstrak sekitar 21 % b/v. Konsentrasi gelling agent yang cukup

56 diharapkan dapat bercampur baik dengan ekstrak daun pepaya agar didapatkan viskositas sediaan yang cukup. 4.8 Formulasi Gel Ekstrak Daun Pepaya Masing-masing basis gel tersebut kemudian diformulasikan dengan penambahan bahanbahan pembantu lainnya untuk mendapatkan stabilita fisik sediaan yang baik, seperti tidak terjadi penurunan viskositas, pemisahan komponen pembentuk sediaan, perubahan bau dan warna (Mitsui, 1997). Formula akhir gel ekstrak daun pepaya dapat dilihat pada tabel 4.11. Tabel 4.11 Formula Gel Ekstrak Daun Pepaya Bahan Formula B 5 M F 5 M B 30 C F 30 C HPC (% b/v) - - 30 30 HPMC (% b/v) 5 5 - - Ekstrak Daun Pepaya (% b/v) - 21-21 Fenoksi etanol (% v/v) 0,5 0,5 0,5 0,5 Metil paraben (% b/v) 0,3 0,3 0,3 0,3 Propilen glikol (% v/v) 15 15 30 30 Natrium metabisulfit (% b/v) 0,1 0,1 0,1 0,1 Disodium EDTA (% b/v) 0,1 0,1 0,1 0,1 Etanol air (1 : 3) ad 100 100 100 100 Keterangan : B F = Basis = Formula gel ekstrak daun pepaya Konsentrasi ekstrak di dalam gel adalah 21 % b/v yang besarnya tiga kali nilai KHM. Penggunaan konsentrasi yang lebih besar daripada KHM diharapkan dapat mempertahankan aktivitas antibakteri dari ekstrak daun pepaya di dalam sediaan gel. Gelling agent jika sudah membentuk gel cenderung meningkatkan pertumbuhan mikroba karena dengan adanya air, gelling agent akan membentuk struktur 3 dimensi melalui ikatan sambung silang (cross linked) akan dapat menjerat air. Banyaknya kandungan air dalam gel tersebut berpotensi untuk mendukung pertumbuhan mikroorganisme. Ekstrak yang mempunyai kandungan steroid / lemak-lemak / minyak dan protein dalam ekstrak dapat

57 mendukung pertumbuhan mikroorganisme karena kandungan tersebut merupakan nutrisi / makanan bagi mikroorganisme (Tabel 4.12). Kontaminasi primer mikroorganisme dari air dapat diperburuk dengan adanya kontaminasi sekunder dari tangan dan lingkungan sekitar (Mitsui, 1997). Oleh karena itu, dalam formulasi diperlukan pengawet yang bersifat bakteriostatik, sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri dan kapang dalam sediaan untuk batas waktu penggunaan yang lama. Pengawet antimikroba yang dapat ditambahkan, yaitu metil paraben dengan konsentrasi 0,3 % (konsentrasi untuk penggunaan topikal = 0,02-0,3 %). Metil paraben lebih efektif terhadap jamur daripada bakteri dan lebih efektif terhadap bakteri gram positif daripada gram negatif, sehingga perlu ditambahkan fenoksi etanol yang efektif terhadap bakteri gram negatif (konsentrasi fenoksi etanol untuk penggunaan topikal = 0,5-1 %), yang terutama disebabkan oleh banyaknya kandungan air dalam ekstrak. Selain itu, penggunaan paraben bersama dengan fenoksi etanol dapat meningkatkan aktivitas pengawet. Tabel 4.12 Karakteristik Umum Mikroorganisme yang berpotensi mengkontaminasi Kosmetik (Mitsui, 1997) Parameter Jamur Ragi (yeast) Bakteri Temperatur pertumbuhan optimum 20-30 o C 25-30 o C 25-37 o C Kanji Gula Protein, asam amino Nutrien yang disukai Makanan yang berasal dari tanaman Makanan yang berasal dari tanaman Makanan yang berasal dari hewan ph pertumbuhan optimum Asam Asam Asam lemah-basa lemah Sifat Aerob Aerob-anaerob Umumnya aerob, beberapa anaerob Produk utama Asam Alkohol, asam, karbon Amina, asam amonia, dioksida karbon dioksida Bacillus subtilis Species khas Penicillium Staphylococcus aureus Saccharomyces Aspergillus Escherichia coli Candida albicans Rhizopus Pseudomonas aeruginosa Kontaminasi kosmetik oleh mikroorganisme ditandai oleh penurunan viskositas sediaan menjadi encer, timbulnya gas SO 2 dan NH 3 yang menyebabkan kosmetik menjadi bau busuk, terjadi perubahan warna, dan terjadi pemisahan pada komponen pembentuk sediaan. Hal ini terjadi karena mikroorganisme yang ada dalam sediaan mengeluarkan enzim yang menyebabkan terjadinya hidrolisis sehingga stabilitas fisik sediaan menjadi menurun.

58 Formula yang mengandung ekstrak sebagai bahan baku mempunyai resiko untuk mengalami oksidasi karena mengandung lemak-lemak/minyak yang umumnya mempunyai dua atau lebih ikatan tak jenuh. Mekanisme oksidasi dapat dikelompokkan menjadi dua tipe, yaitu autooksidasi dan oksidasi non-radikal (oksidasi non-radikal terjadi jika ada ozon dan oksigen single). Autooksidasi terjadi melalui reaksi rantai radikal dengan adanya 20 % oksigen di udara dan merupakan mekanisme yang paling sering terjadi dalam kosmetik. Respon autooksidasi dipercepat dengan adanya panas, sinar UV, ion logam (terutama besi dan tembaga), air, dan protein (Mitsui, 1997). Reaksi autooksidasi merupakan reaksi berantai, yang menyebabkan H 2 O 2 terakumulasi, sehingga reaksi oksidasi dapat terjadi kembali secara berulang-ulang. 2 H 2 O + O 2 2 H 2 O 2 Untuk mencegah reaksi autooksidasi, maka reaksi inisiasi dan reaksi transfer rantai harus ditekan. Reaksi inisiasi dapat ditekan dengan menyimpan sediaan di tempat yang sejuk dan mencegah paparan sinar UV dengan menggunakan wadah yang dapat menyerap sinar UV (berwarna gelap). Lipida peroksida merupakan sumber dari munculnya radikal, maka peroksida harus diuraikan dengan mekanisme non-radikal, yaitu dengan menggunakan chelating agent. Reaksi pembentukan radikal dapat ditekan dengan menangkap radikal tersebut secepat mungkin, yaitu dengan menambahkan antioksidan sehingga reaksi rantai tersebut dapat terputus. Proses oksidasi yang terjadi menyebabkan perubahan warna, bau (menjadi tengik), dan penurunan viskositas (menjadi semakin encer). Hal ini disebabkan oleh putusnya ikatan rangkap dari sediaan sehingga ikatan menjadi lebih lemah dan lebih mudah putus. Oleh karena itu perlu ditambahkan natrium metabisulfit sebagai antioksidan (0,01-0,1 % b/v). Air yang digunakan dalam formulasi berpotensi untuk mengandung ion-ion logam meskipun jumlahnya mikro, tetapi sangat mempengaruhi viskositas sediaan karena ion-ion logam tersebut menarik gugus-gugus fungsi dari gelling agent membentuk kompleks yang menyebabkan penurunan viskositas. Oleh karena itu, perlu ditambahkan disodium EDTA yang digunakan sebagai khelating agent dengan konsentrasi 0,005 0,1 % b/v untuk sediaan topikal. Disodium EDTA berfungsi untuk mencegah oksidasi (yang dikatalisis oleh ion logam) dengan membentuk kompleks radikal yang terbentuk atau oksigen.

59 Dalam penyimpanan sediaan gel dalam waktu tertentu akan mengakibatkan terjadinya sineresis, yaitu proses keluarnya air dari struktur gel akibat terjadinya kontraksi volume karena fluktuasi suhu pada penyimpanan. waktu lama dan terjadi fluktuasi suhu pada penyimpanan gel. Cairan yang terjerat akan keluar dan berada di atas permukaan gel. Untuk mengatasi keadaan ini dapat dilakukan penambahan humektan. Humektan adalah suatu bahan higroskopis yang mempunyai sifat dapat meningkatkan viskositas air yang terjerat, mengikat air dari udara yang lembab dan sekaligus mempertahankan air yang ada pada sediaan. Humektan dapat mempertahankan kadar air pada sediaan yang dioleskan di permukaan kulit dan mendistribusikan kelembaban tersebut ke epidermis sampai pada suhu dan derajat kelembaban relatif tertentu (Mitsui, 1997). Jumlah air yang banyak akan menghidrasi stratum corneum, sehingga terjadi perubahan permeabilitas stratum corneum menjadi lebih permeabel terhadap zat aktif yang dapat meningkatkan permeasi zat aktif. Propilen glikol dapat digunakan sebagai humektan, tetapi dapat juga digunakan sebagai pengawet antimikroba dan disinfektan, di mana aktivitas antiseptiknya mirip dengan etanol dan aktivitas terhadap jamur mirip dengan gliserin. Sebagai humektan, propilen glikol dapat meningkatkan viskositas air yang terjerat dalam struktur tiga dimensi sehingga air yang terjerat tidak akan keluar ke permukaan gel. Sebagai pengawet, propilen glikol yang berada di luar membran sel mikroorganisme akan menyebabkan isi sitoplasma mikroorganisme keluar berdasarkan gradien konsentrasi dan akhirnya mikroorganisme akan mengalami lisis. Etanol-air selain digunakan sebagai pelarut ekstrak daun pepaya (untuk menunjang homogenitas ekstrak daun pepaya dalam gel), dapat juga berfungsi untuk penetration enhancer, yaitu molekul yang dapat mengurangi tahanan barrier dari stratum corneum secara reversible, sehingga absorpsi perkutan zat aktif melalui stratum corneum dapat ditingkatkan (cepat mencapai viable epidermis) (Barry, 1987). Mekanisme hidrasi, yang merupakan efek dari pengurangan tahanan barrier, dapat dilihat pada gambar 4.15.

60 Gambar 4. 15 Mekanisme hidrasi 4.9 Evaluasi Sediaan Gel Ekstrak Daun Pepaya Evaluasi gel ekstrak daun pepaya meliputi evaluasi fisik dan biologi. Evaluasi fisik meliputi evaluasi homogenitas, pengukuran viskositas dan ph sediaan serta pengamatan terhadap terjadinya sineresis, pertumbuhan mikroba dan perubahan warna serta bau pada gel ekstrak daun pepaya. Evaluasi biologi meliputi penentuan aktivitas antibakteri sediaan gel ekstrak daun pepaya terhadap Staphylococcus epidermidis. 4.9.1 Evaluasi Penampilan Sediaan Evaluasi penampilan gel ekstrak daun pepaya dilakukan dengan membandingkan formula gel ekstrak daun pepaya dengan basis gel HPC-LV (F 30 C ) dan basis HPMC (F 5M ). Hasil evaluasi terlihat pada tabel 4.13 dan 4.14. Tabel 4.13 Evaluasi Penampilan Gel Ekstrak Daun Pepaya dengan Basis HPC-LV(F 30 C ) Parameter Pengamatan hari ke- 0 7 14 21 28 Bau Khas Khas Khas Khas Khas Warna Coklat tua Coklat tua Coklat tua Coklat tua Coklat tua Pertumbuhan Mikroba X X X X x Sineresis X X X X x Homogenitas + + + + + Keterangan : (x) = tidak terjadi (v) = terjadi (+) = terdispersi homogen

61 Tabel 4.14 Evaluasi Penampilan Gel Ekstrak Daun Pepaya dengan Basis HPMC (F 5M ) Parameter Pengamatan hari ke- 0 7 14 21 28 Bau Khas Khas Khas Khas Khas Warna Coklat tua Coklat tua Coklat tua Coklat tua Coklat tua Pertumbuhan Mikroba X X X X x Sineresis X X X X x Homogenitas + + + + + Keterangan : (x) = tidak terjadi (v) = terjadi (+) = terdispersi homogen Hasil evaluasi penampilan sediaan menunjukkan bahwa formula dengan basis HPC-LV (F 30C ) dan HPMC (F 5M ) baik dan stabil secara fisik. 4.9.2 Pengukuran ph Sediaan Hasil evaluasi sediaan gel ekstrak daun pepaya menunjukkan ph sediaan gel ekstrak daun pepaya stabil selama penyimpanan, baik dengan menggunakan basis HPC-LV (F 30C ) maupun HPMC (F 5M ), seperti terlihat pada gambar 4.16 dan 4.17. 5.90 5.70 ph 5.50 5.30 5.10 4.90 Basis 1 Basis 2 Formula 1 Formula 2 Formula 3 4.70 1 7 14 21 28 Waktu (hari) Gambar 4.16 Evaluasi ph formula gel ekstrak daun pepaya dengan basis HPC-LV (F 30C )

62 5.90 5.70 ph 5.50 5.30 5.10 4.90 Basis 1 Basis 2 Formula 1 Formula 2 Formula 3 4.70 1 7 14 21 28 Waktu (hari) Gambar 4.17 Evaluasi ph formula gel ekstrak daun pepaya dengan basis HPMC (F 5M ) Hasil terlihat bahwa ph formula (F 30C ) tidak mengubah ph atau tidak berbeda secara bermakna dibandingkan dengan basis (B 30C ). Hal ini menunjukkan bahwa formula gel ekstrak daun pepaya yang menggunakan basis HPC-LV mempunyai ph yang stabil dan mendekati ph basis HPC-LV dibandingkan terhadap formulasi dengan basis HPMC. ph formula dengan menggunakan basis HPMC (F 5M ) berbeda secara bermakna dibandingkan dengan basis (B 5M ). Penurunan ph ini menyebabkan penurunan bobot molekul dari polimer dan terjadinya pemutusan ikatan hidrogen (reaksi hidrolitik), sehingga terjadi penurunan kekuatan fisik sediaan. 4.9.3 Pengukuran Viskositas Sediaan Hasil evaluasi sediaan gel ekstrak daun pepaya menunjukkan viskositas sediaan gel ekstrak daun pepaya stabil selama penyimpanan, baik dengan menggunakan basis HPC-LV (F 30C ) maupun HPMC (F 5M ), seperti terlihat pada gambar 4.18 dan 4.19.

63 Viskositas (cp) 500000 450000 400000 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 1 7 14 21 28 Waktu (hari) Basis 1 Basis 2 Formula 1 Formula 2 Formula 3 Gambar 4.18 Evaluasi viskositas formula gel ekstrak daun pepaya dengan basis HPC-LV (F 30C ) Viskositas (cp) 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 1 7 14 21 28 Waktu (hari) Basis 1 Basis 2 Formula 1 Formula 2 Formula 3 Gambar 4.19 Evaluasi viskositas formula gel ekstrak daun pepaya dengan basis HPMC (F 5M ) Hasil terlihat bahwa viskositas formula (F 30C ) tidak mengubah viskositas atau tidak berbeda secara bermakna dibandingkan dengan (B 30C ). Hal ini menunjukkan bahwa formula gel ekstrak daun pepaya yang menggunakan basis HPC-LV mempunyai viskositas yang stabil dan mendekati viskositas basis HPC-LV dibandingkan terhadap formulasi dengan basis HPMC. Pada proses pembuatan gel digunakan pelarut etanol-air (1:3) untuk menghindari ketidakhomogenan basis dengan ekstrak daun pepaya yang merupakan ekstrak etanol-air

64 (1:3). Namun, HPC-LV mempunyai kelarutan lebih baik dalam etanol, sedangkan HPMC tidak larut dalam etanol tetapi larut dalam etanol-air sehingga menyebabkan HPMC kurang larut di dalam etanol-air (1:3). Hal ini menyebabkan ikatan sambung silang yang terbentuk pada HPMC lebih lemah, sedangkan HPC-LV larut baik dalam etanol-air (1:3) sehingga ikatan sambung silang yang terbentuk lebih kuat. Perbedaan gugus substitusi antara HPC- LV dan HPMC untuk menunjang kelarutannya (gambar 4.20 dan 4.21). Gambar 4.20 Struktur Dasar Selulosa Gambar 4.21 Gugus Substitusi pada HPC-LV dan HPMC 4.9.4 Penentuan Aktivitas Antibakteri Sediaan Gel Ekstrak Daun Pepaya terhadap Staphylococcus epidermidis Gel ekstrak daun pepaya tersebut kemudian ditentukan aktivitasnya terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis dan dibandingkan dengan aktivitas gel tetrasiklin hidroklorida. Hasil uji terlihat pada gambar 4.22. Pada penentuan aktivitas antibakteri gel, dilakukan juga uji terhadap basis gel saja (HPMC 5 % dan HPC-LV 30 %). Hal ini dilakukan untuk menguji apakah basis menunjukkan aktivitas antibakteri.

65 Gambar 4.22 Keterangan : (a.) Diameter zona hambat gel ekstrak daun pepaya terhadap Staphylococcus epidermidis (a.) = dengan basis HPC-LV, (b.) = dengan basis HPMC, F 30C / F 5M = Gel Ekstrak Daun Pepaya, B 30C / B 5M = Basis gel, E = Ekstrak 21 % b/v dalam etanol air (25:75), G C / G M = Gel Tetrasiklin, T = Tetrasiklin 3 % b/v dalam dapar HCl 0,1 N (b.) Tabel 4.15 Aktivitas Antibakteri Sediaan Gel Ekstrak Daun Pepaya terhadap Staphylococcus epidermidis Sediaan Uji Basis HPC-LV Diameter zona hambat (mm) Basis HPMC Tanpa Basis Gel Ekstrak Daun Pepaya (F 30C / F 5M ) 19,80 ± 0,30 15,27 ± 0,25 Ekstrak 21 % b/v dalam etanol air 1:3 (E) 20,25 ± 0,07 Gel Tetrasiklin (G C / G M ) 16,20 ± 0.10 13,10 ± 0,50 Tetrasiklin 3 % b/v dalam dapar HCl 0,1 N (T) 17,82 ± 0,49 Basis (B 30C / B 5M ) - - Keterangan : (-) = tidak menunjukkan adanya zona hambat Hasil uji (tabel 4.15) menunjukkan bahwa aktivitas gel ekstrak daun pepaya (formula) menunjukkan adanya zona hambat terhadap Staphylococcus epidermidis. Namun, efektifitas gel ekstrak daun pepaya lebih tinggi jika menggunakan basis HPC-LV daripada HPMC, yang didukung pula oleh hasil analisis statistik pada lampiran D (berbeda secara bermakna). Efektifitas ini berkaitan dengan afinitas ekstrak daun pepaya pada basis gel.

66 Ekstrak daun pepaya terikat lebih kuat pada basis HPMC daripada HPC-LV. Hal ini juga terlihat dengan menurunnya aktivitas dari ekstrak daun pepaya jika sudah diformulasikan menjadi sediaan gel, yang didukung oleh hasil analisis statistik pada lampiran D (tidak berbeda secara bermakna untuk F 30C terhadap E dan berbeda secara bermakna untuk F 5M terhadap E). Adanya zona hambat yang ditunjukkan dari gel ekstrak daun pepaya menunjukkan bahwa formula gel ekstrak daun pepaya dapat terlepas baik dari basisnya dan berkhasiat terhadap Staphylococcus epidermidis. Staphylococcus epidermidis sebenarnya merupakan flora normal pada kulit, namun infeksi lokal yang dapat ditimbulkan adalah berupa jerawat dan infeksi pada infundibulum rambut. Peradangan primer yang dipicu oleh Propionibacterium acnes dapat bertambah parah akibat infeksi sekunder oleh infeksi sekunder S. epidermidis akan bertambah parah jika jerawat sudah bernanah. Gel ekstrak daun pepaya efektif terhadap Staphylococcus epidermidis, tetapi tidak efektif terhadap Propionibacterium acnes. Hal ini berarti bahwa gel ekstrak daun pepaya bermanfaat untuk mencegah bertambah parahnya jerawat, yaitu mencegah terjadinya infeksi sekunder oleh Staphylococcus epidermidis. Diameter zona hambat untuk gel ekstrak daun pepaya dengan basis HPC-LV adalah 19,80 ± 0,30 mm, sedangkan dengan basis HPMC adalah 15,27 ± 0,25 mm. Berdasarkan hasil evaluasi ph dan viskositas, gel ekstrak daun pepaya dengan basis HPC-LV 30 % b/v lebih stabil secara fisik daripada gel ekstrak daun pepaya dengan basis HPMC 5 % b/v. Gel ekstrak daun pepaya dengan basis HPC-LV lebih efektif dan lebih stabil dibandingkan dengan basis HPMC.