BAB III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei Juli 2013 di Bintan Provinsi Kepulauan Riau (Gambar 4). Dimana penelitian ini meliputi persiapan alat dan bahan, survey lapangan, transplantasi lamun, analisis substrat di Laboratorium Tanah Fakultas Pertanian UNPAD, uji fitokimia di Laboratorium Bioteknologi Kelautan FPIK UNPAD dan pengolahan data. Pulau Bintan memiliki kawasan yang merupakan salah satu daerah perlindungan lamun yang tergabung di TRISMADES ( Trikora Seagrass Management Demonstration Site) di sepanjang Laut Cina selatan. Kawasan ini dikenal untuk pemanfaatan dalam kegiatan penelitian, pendidikan, budidaya laut, dan ekowisata bahari (BAPPEDA Bintan, 2008). Gambar 4. Peta Lokasi Penelitian 24
25 3.2 Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1 Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : a. Sepatu koral (coral boot), digunakan untuk melindungi kaki dari karang dan hewan laut yang berbahaya. b. Secchi disk, digunakan untuk mengukur kecerahan. c. Roll meter berukuran 100 m, digunakan untuk mengukur kedalaman dan wilayah yang akan ditanam. d. Transek kuadrat berukuran 1 x 1 m² sebagai penata untuk proses penanaman lamun, sekop untuk mengambil bibit lamun. e. Tali, bola, stopwatch, digunakan untuk mengukur kecepatan arus. f. Termometer, digunakan untuk mengukur suhu air laut. g. Refraktometer, digunakan untuk mengukur salinitas air laut. h. ph meter, digunakan untuk mengukur derajat keasaman air laut. i. GPS (Global Position System), digunakan untuk menentukan posisi lokasi penelitian. j. Kamera digital, digunakan untuk mendokumentasikan kegiatan. k. Sabak, pensil 2B dan penggaris untuk alat tulis bawah air serta untuk mengukur panjang daun lamun. l. Streples, digunakan untuk penandaan pada daun lamun. m. Laptop dan seperangkat software microsoft exel 2007 untuk pengolahan data. 3.2.2 Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah : a. Bibit lamun Enhalus acoroides, digunakan untuk material tanam. b. Sampel substrat, untuk mengetahui kandungan Nitrat dan Fosfat. c. Pereaksi Meyer dan Peraksi Wagner. d. Pereaksi Lieberman Burchard (H2SO4 + asam asetat anhidrida). e. Metanol f. Ammonia 10% g. HCl Pekat
26 h. HCl 1 N dan 2 N i. Bubuk magnesium j. Asam klorida pekat dan Amil alkohol k. FeCl3 5% 3.3 Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental dengan Rancangan Acak Kelompok (RAK). Sebagai kelompok adalah substrat. Setiap kelompok terdiri atas 2 perlakuan (Gambar 5) yaitu transplantasi dengan kerapatan (rapat) (A) dan transplantasi dengan kerapatan (jarang) (B), dimana setiap perlakuan diulang sebanyak 5 kali. Terdapat 5 kelompok dengan kriteria sebagai berikut (Kiswara, 2005) : 1. Kelompok satu : substrat pasir (Stasiun 1) 2. Kelompok dua : substrat lumpur (Stasiun 2) 3. Kelompok tiga : substrat pasir berlumpur (Stasiun 3) 4. Kelompok empat : substrat lumpur berpasir (Stasiun 4) 5. Kelompok lima : substrat campuran pecahan karang (Stasiun 5) 3.4 Prosedur Penelitian Gambar 5. Perlakuan dalam proses penanaman lamun 3.4.1 Penentuan Titik Stasiun Pada penelitian ini terdapat empat titik stasiun dimana setiap titik stasiun tersebut ditentukan berdasarkan perwakilan kelompok substrat di lokasi tersebut di mana:
27 a. Stasiun 1 (00 o 59 43,9 LU, 104 o 38 40,8 BT) merupakan kelompok substrat pasir. b. Stasiun 2 (00 o 59 45,0 LU, 104 o 38 40,1 BT) merupakan kelompok substrat lumpur. c. Stasiun 3 (00 o 59 42,9 LU, 104 o 38 44,0 BT) merupakan kelompok substrat pasir berlumpur. d. Stasiun 4 (00 59 44,8 LU, 104 38 40,0 BT) merupakan kelompok substrat lumpur berpasir. e. Stasiun 5 (01 03 57,5 LU, 104 38 57,6 BT) merupakan kelompok substrat campuran pecahan karang. 3.4.2 Tahap Persiapan Tahap persiapan meliputi persiapan alat-alat yang akan digunakan dalam pelaksanaan penanaman. Sekop atau linggis yang digunakan untuk mengambil bibit lamun, serta peralatan lainnya seperti roll meter, GPS, dan peralatan lainnya. 3.4.3 Tahap Pelaksanaan Pengambilan Bibit Lamun Pengambilan material lamun atau bibit lamun yang diambil dari sumber bibit (padang lamun donor), yaitu : untuk metode plug, pengambilan bibit lamun utuh dilakukan dengan menggunakan sekop tanpa substrat alaminya. Penanaman Lamun Penanaman lamun dengan metode plug yaitu (Cholifah, 2011) : a. Penanaman dilakukan dengan sistem rumpun berjarak b. Jumlah bibit pada tiap tegakan sebanyak 25 bibit/pu (planting units of seagrass) untuk kerapatan yang rapat, dan 9 bibit untuk kerapatan yang jarang. c. Transek kuadrat berukuran 1 x 1 m² di letakkan pada substrat yang ditentukan. d. Lubang tanam dibuat di lokasi penanaman dengan diameter ±10-15 cm dengan kedalaman 20 sampai 25 cm.
28 e. Material lamun/pu (planting units of seagrass) ditanam ke dalam lubang tanam dengan jarak rapat dan jarang antara lamun yang satu dengan lamun lainnya. f. Lamun yang sudah ditanam kemudian diberi tanda dengan memasang patok dan pemberian tagging pada daun lamun. g. Pengamatan dilakukan selama kurang lebih dua bulan. Prosedur Uji Fitokimia Uji fitokimia dilaksanakan setelah pengukuran laju pertumbuhan lamun Enhalus acoroides hasil transplantasi pada akhir penelitian. Uji fitokimia meliputi (Lampiran 1): 1. Uji Alkaloid Sebanyak 1 gram sampel ditimbang, kemudian sampel tersebut dilarutkan dengan ammonia (NH4OH) 10% sampai sampel terendam, kemudian ditambahkan CHCl3 lalu dikocok dan disaring. Filtrat kemudian diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan HCl 1 N lalu dikocok. Setelah itu lapisan asam diambil dan dipisahkan ke dalam tabung reaksi lain lalu diteteskan di atas kaca arloji. Kemudian masing-masing diberi 2 pereaksi, diantaranya yaitu ditambahkan 2 tetes pereaksi Meyer, hasil positif ditandai dengan adanya endapan putih. 2 tetes pereaksi Wagner, hasil positif ditandai dengan adanya endapan coklat merah. 2. Uji Flavonoid Sebanyak 1 gram sampel dicacah sampai halus dan dididihkan dengan 25 ml metanol selama ± 10 menit, kemudian disaring dalam keadaan panas dan pelarut diuapkan sampai kering. Selanjutnya ditambahkan kloroform dan air suling (1 : 1) sebanyak 5 ml kemudian dikocok dan dibiarkan sejenak hingga terbentuk dua lapisan kloroform air (lapisan kloroform di bagian bawah dan lapisan air di bagian atas). Sebagian dari lapisan air diambil dengan pipet ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 0,1 gram bubuk magnesium dan masing-masing beberapa tetes asam klorida
29 pekat dan amil alkohol. Hasil positif adanya flavonoid adalah terbentuknya warna orange merah. 3. Uji Fenolik Sebagian lapisan air dari hasil uji flavonoid dimasukkan ke dalam plat tetes atau kaca arloji dan kemudian ditambahkan pereaksi FeCl3 5%. Adanya kandungan senyawa fenolik ditandai dengan terbentuknya warna biru ungu. 4. Uji Triterpenoid dan Steroid Lapisan kloroform dari uji flavonoid diambil sedikit lalu diteteskan ke plat tetes dan dibiarkan sampai kering. Kemudian ditambahkan satu tetes asam asetat anhidrida dan satu tetes asam sulfat pekat (Pereaksi Liebermann Burchard). Pada uji triterpenoid dan steroid, apabila terbentuknya warna merah artinya adalah positif mengandung triterpenoid dan terbentuknya warna biru atau ungu merupakan tanda positif untuk senyawa steroid. 5. Uji Saponin Sebanyak 1 gram sampel dimasukkan kedalam Erlenmeyer dan ditambahkan 40 ml akuades kemudian dipanaskan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas kemudian filtrat tersebut diambil sebanyak 10 ml dan dikocok dengan kuat secara vertikal selama 10 detik. Hasil positif sampel tersebut mengandung saponin, akan terbentuk busa yang stabil tidak kurang dari 1-10 cm dan tidak hilang pada penambahan satu tetes HCl 2 N. 6. Uji Tanin 1 gram sampel ditambah air kemudian dididihkan beberapa menit dan di saring. Sebanyak 2 ml filtrat hasil penyaringan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi FeCl3 5%. Hasil positif mengandung tanin terlihat dengan terjadinya warna biru tua atau hijau kehitaman.
30 3.4.4 Pengukuran Pertumbuhan Panjang Daun Lamun dan Kelangsungan Hidup Lamun Enhalus acoroides Pada penelitian ini pengukuran panjang pertumbuhan daun lamun diukur dari penandaan awal sampai akhir penelitian dengan jarak pengukuran dua minggu sekali. Daun lamun muda diukur pada awal penanaman, kemudian diberi tanda dengan streples pada bagian atas rhizoma. Panjang pertumbuhan daun lamun baru dapat diukur ketika streples yang berfungsi sebagai tanda mulai naik ke atas dari tempat awal penandaan. Untuk pengamatan kelangsungan hidup lamun yaitu melihat lamun yang masih hidup pada tempat penanaman dari awal penelitian sampai akhir penelitian. Lamun yang ditanam ada kemungkinan terbawa oleh arus laut ataupun mengalami kematian akibat faktor-faktor eksternal yang menyebabkan terancamnya kelangsungan hidup lamun itu sendiri. 3.4.5 Pengambilan Data Fisik dan Kimia Perairan Pengukuran parameter fisik dan kimia dilakukan setiap dua minggu sekali dengan tiga kali pengulangan pada masing-masing stasiun (Tabel 2). Sampel substrat diambil dari masing-masing stasiun penelitian dan dimasukkan kedalam botol 600 ml kemudian kandungan nitrat (NO3) dan fosfat (P) dalam substrat dianalisis secara eksitu. Tabel 2. Parameter Kualitas Air Parameter Alat Keterangan A. Fisika - Suhu Termometer In situ - Kecerahan Secchi disk In situ - Kedalaman Tongkat berkala In situ - Kecepatan arus Bola dan Tali In situ B. Kimia - ph ph meter In situ - Salinitas Refraktometer In situ - DO DO meter In situ - Nitrat dalam substrat - Laboratorium - Fosfat dalam substrat - Laboratorium
31 3.4.6 Identifikasi Metabolit Sekunder Tabel 3. Identifikasi Metabolit Sekunder Uji Fitokimia Uji Alkaloid Uji Flavonoid Uji Triterpenoid atau Steroid Uji Saponin Uji Tanin Uji Fenolik Parameter yang diamati + jika terbentuk endapan putih/endapan coklat merah + jika terbentuk warna orange merah + jika terbentuk warna merah/biru/ungu + jika terbentuk busa stabil 1-10 cm + jika terbentuk warna biru/hijau kehitaman + jika terbentuk warna biru-ungu 3.5 Pengolahan Data 3.5.1 Pertumbuhan daun lamun Gambar 6. Penampang pertumbuhan daun lamun (Sumber : Badria, 2007) Berdasarkan pengerjaan pertumbuhan daun lamun seperti Gambar 6 dibuat rumus pertumbuhan daun lamun sebagai berikut (Badria, 2007) : Kt = Keterangan : Kt = Pertumbuhan lamun (cm/hari) T = Waktu interval pengamatan (hari) at = Panjang total daun hari ke-t (cm) bt = Panjang total daun di atas lubang penandaan hari ke-t (cm)
32 3.5.2 Kelangsungan hidup lamun (2003). Kelangsungan hidup lamun dihitung dengan menggunakan rumus Effendi Keterangan : SR = Survival Rate (%) Nt No SR = 100% = Jumlah lamun yang hidup pada akhir pengamatan = Jumlah bibit lamun pada awal pengamatan. 3.6 Analisis Data Analisis parameter fisika dan kimia perairan tersebut akan dijelaskan secara deskriptif dengan menampilkan tabel serta grafik. Untuk pengaruh perlakuan terhadap tingkat kelangsungan hidup (SR) dan laju pertumbuhan daun lamun dianalisis menggunakan analisis varians dengan uji F, apabila terdapat perbedaan antar perlakuan dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan dengan taraf kepercayaan 95%. Metode perhitungan sidik ragam menurut Cholifah (2011) adalah : Xij = µi + j + ij + j Keterangan : Xij : Hasil pengamatan pada perlakuan ke-i ulangan ke-j µi : Rata-rata umum j : pengaruh perlakuan ke-i ij : Pengaruh faktor random perlakuan ke-i dan ulangan ke-j j : Pengaruh perlakuan ke-j