BAB III BAHAN DAN METODE 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1. Tempat Penelitian Sampling bakteri kitinolitik dilakukan di beberapa lokasi sekitar Pelabuhan Perikanan Nusantara (PPN) Kejawanan Cirebon. Kegiatan penelitian dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Perikanan dan Kelautan FPIK Unpad. 3.1.2. Waktu Penelitian Persiapan penelitian dilaksanakan pada bulan Januari 2013. Kegiatan penelitian utama dilakukan pada bulan Februari Mei 2013. 3.2. Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1. Alat Utama a. Sampling Limbah Udang dan Kepiting - 4 buah botol film untuk menyimpan sampel. - Termos es untuk menyimpan sampel selama perjalanan sampling. - ph indikator untuk mengukur ph sampel. - Kamera digital untuk dokumentasi kegiatan. - Alat tulis untuk mencatat hasil kegiatan sampel. b. Pembuatan Koloidal Kitin - Erlenmeyer untuk menyimpan koloidal kitin. - Hot plate magnetic stirrer untuk menghomogenkan koloidal kitin. - Tube Falcon tempat koloidal kitin yang akan disentrifuse. - Sentrifuse untuk memisahkan endapan dengan supernatan koloidal kitin. c. Isolasi dan Pemurnian Bakteri - 12 buah cawan petri untuk tempat medium agar. - Mikropipet ukuran 100-1000 µl untuk mengambil sampel. - Inkubator untuk menginkubasi bakteri. - Autoklaf untuk proses sterilisasi. - Hot plate magnetic stirer untuk melarutkan medium. - 3 buah Erlenmeyer untuk menyimpan medium. - 12 buah tabung reaksi untuk menyimpan NaCl fisiologis. - Rak tabung reaksi untuk menyimpan tabung reaksi. - Gelas ukur 100 ml untuk mengukur volume larutan.
- Bunsen untuk mencegah kontaminasi. - L Glass untuk meratakan sampel pada medium. - Jarum ose untuk mengambil koloni bakteri. - Laminar air flow untuk tempat melakukan kultur bakteri. - Timbangan digital untuk menimbang bahan. - Spatula untuk mengambil bahan yang akan ditimbang. - Vortex untuk menghomogenkan bakteri dengan NaCl fisiologis. d. Pengamatan dan Pewarnaan Bakteri - Objek glass untuk tempat pembuatan preparat. - Mikroskop untuk mengamati preparat. - 4 buah pipet tetes untuk meneteskan pewarna dan NaCl fisiologis - Bunsen untuk mencegah kontaminasi. - Jarum ose untuk mengambil koloni bakteri. e. Uji Aktivitas Kitinolitik - 2 buah cawan petri untuk tempat medium dan pengujian. - Jarum ose untuk memindahkan koloni bakteri murni ke cawan petri yang berisi medium. - Inkubator untuk melakukan inkubasi bakteri sebelum pengujian. - Hot Plate magnetic stirer untuk melarutkan medium. - Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat memindahkan bakteri. - Gelas ukur 100 ml untuk mengukur volume larutan. - Timbangan digital untuk menimbang bahan. - Jangka sorong digital untuk mengukur diameter zona bening. - Erlenmeyer untuk menyimpan medium. - Autoklaf untuk proses sterilisasi. - Spatula untuk mengambil bahan. f. Uji Aktivitas Anti Jamur Saprolegnia sp. - 8 buah cawan petri untuk tempat medium dan pengujian. - Erlenmeyer untuk menyimpan medium. - Jarum ose untuk mengambil bakteri.
- Gelas ukur 100 ml untuk mengukur volume larutan. - Spatula untuk mengambil bahan. - Timbangan digital untuk menimbang bahan. - Autoklaf untuk proses sterilisasi. - Inkubator untuk menginkubasi bakteri. - Hot plate magnetic stirer untuk melarutkan medium. - Bunsen untuk mencegah kontaminasi. g. Identifikasi Bakteri dengan 16S rrna dan Fragmen Penyandi Kitinase 1. Kultur Cair - Erlenmeyer untuk menyimpan medium. - Tabung reaksi untuk tempat kultur cair. - Jarum ose untuk memindahkan biakan bakteri. - Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat pemindahan bakteri. - Shaker Incubator untuk menginkubasi bakteri. 2. Isolasi DNA Genom Bakteri - Rak microtube untuk menyimpan microtube. - Mikropipet ukuran 0,5-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl untuk mengambil larutan. - Sentrifuse untuk memisahkan larutan dengan supernatan. - Tube 1,5 ml untuk menyimpan ekstrak DNA. - Waterbath untuk inkubasi ekstrak DNA. - Vortex untuk menghomogenkan larutan. 3. Polymerase Chain Reaction (PCR) - Thermal cycler untuk melakukan amplifikasi DNA. - Microtube untuk wadah komponen PCR. - Mikropipet ukuran 0,5-10 µl dan 10-100 µl untuk mengambil primer dan Master mix. 4. Elektroforesis Gel Agarose - Gelas ukur untuk mengukur volume larutan Tris Borat EDTA (TBE). - Timbangan digital untuk menimbang agarose.
- Perspex (sisir) untuk mencetak gel agarose dan membuat sumur-sumur untuk penempatan hasil isolasi. - Hot plate magnetic stirrer untuk membuat larutan agarose dengan pelarut TBE. - Sendok pipih untuk memindahkan gel agarose. - Trays elektroforesis untuk memisahkan pita DNA dengan bantuan arus listrik. - Power supply untuk penyalur arus listrik. - Ultraviolet Transilluminator untuk melihat hasil akhir elektroforesis. 3.2.2 Alat Penunjang Kapas, karet, gunting, alluminium foil kertas, korek, parafilm, kertas label, plastik, plastik wrap, plastik tahan panas sebagai alat penunjang kegiatan penelitian. Masker dan sarung tangan untuk melindungi dari bahan-bahan beracun. Alat-alat penelitian disajikan pada Lampiran 1. 3.2.3 Bahan a. Sampling Limbah Udang dan Kepiting - NaCl fisiologis - Es batu b. Pembuatan Koloidal Kitin - Cangkang udang - HCl pekat - NaOH 10 N - Akuades - Glass wool c. Isolasi Bakteri - Medium agar kitin terdiri dari koloidal kitin, yeast extract, NaCl, (NH 4 ) 2 SO 4, MgSO 4. 7H 2 O, agar, K 2 HPO 4.
- Akuades. - Alkohol 70% - NaCl fisiologis - Sampel limbah udang dan kepiting d. Pengamatan dan Pewarnaan Bakteri - Alkohol - Akuades - Pewarna I (gentian violet) - Lugol - Pewarna II (air fuchsin) - NaCl fisiologis 0,9 % e. Uji Aktivitas Kitinolitik - Medium agar kitin terdiri dari koloidal kitin, yeast extract, NaCl, (NH 4 ) 2 SO 4, MgSO 4. 7H 2 O, agar, K 2 HPO 4. - Akuades f. Uji Aktivitas Anti Jamur Saprolegnia sp. - Medium Potato Dextrose Agar (PDA) - Khloramfenikol. - Biakan Saprolegnia sp. - Bakteri hasil kultur. g. Identifikasi Bakteri Secara Molekuler 1. Kultur Cair - Medium Nutrien broth - Koloidal kitin - Akuades 2. Isolasi DNA - 50 mm EDTA. - Lysozyme. - Nuclei lysis solution. - RNAse solution. - Protein precipitation solution.
- Isopropanol. - Ethanol 70 %. - Rehydration solution. 3. Amplifikasi Gen 16S rrna - DNA template. - PCR Master Mix (KAPA2G Fast Ready Mix PCR Kit). - Primer Forward F 16S rrna. - Primer Reverse R 16S rrna. - Nuclease Free Water. 4. Elektroforesis - Gel agarose. - Larutan pemberat dan pewarna (Loading dye). - Larutan TBE. - Ethidium Bromide (EtBr). - DNA ladder 1 kb (Geneaid). - Akuades. 5. Amplifikasi gen penyandi enzim kitinase - Primer forward ChiE-F. - Primer reverse ChiE-R. - DNA template. - Nuclease Free Water. - Go Taq Green Master Mix. Bahan-bahan penelitian disajikan pada Lampiran 2. 3.3. Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksploratif, data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif. Dengan alur penelitian sebagai berikut:
Sampling limbah udang dan kepiting Kultivasi bakteri (medium agar kitin) Pewarnaan gram positif dan negatif bakteri kitinolitik Aktivitas kitinolitik (pengambilan 2 isolat terbaik) Uji aktivitas jamur Saprolegnia sp. Isolasi DNA genom bakteri kitinolitik Analisis molekuler 16S rrna Determinasi strain bakteri Primer ChiE-F dan ChiE-R Sekuensing (Analisis bioinformatika) program BLAST Determinasi potensi bakteri penghasil kitinase
3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Sampling Limbah Udang dan Kepiting Pengambilan sampel dilakukan di daerah sekitar wilayah Pelabuhan Perikanan Nusantara (PPN) Kejawanan Cirebon. Sampel yang telah diambil disimpan dalam botol film yang berisi NaCl fisiologis 0,9 %, kemudian dimasukan kedalam termos es yang berisi es, penyimpanan dalam suhu dingin bertujuan untuk menghambat aktivitas bakteri dalam memproduksi enzim. 3.4.2 Pembuatan Koloidal Kitin Koloidal kitin dibuat berdasarkan metode yang dilakukan Nasran et al. dalam Ilmi (2007). Sebanyak 10 gram cangkang udang dilarutkan dalam 200 ml HCL pekat, kemudian diinkubasi semalam pada suhu 4 0 C. Larutan tersebut kemudian disaring menggunakan glass-wool lalu ditambah 100 ml akuades dingin. Keasaman larutan dinetralkan menggunakan NaOH 10 N, kemudian dilakukan sentrifugasi 8.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 0 C. Endapan yang terbentuk dikumpulkan dan dicuci menggunakan akuades dingin, selanjutnya disentrifugasi kembali. Penyucian diulang beberapa kali hingga didapatkan endapan berwarna putih kecoklatan yang merupakan koloidal kitin (Lampiran 3). 3.4.3 Sterilisasi Alat dan Medium Sebelum melakukan isolasi maupun pemurnian bakteri, perlu dilakukan sterilisasi alat guna mencegah kontaminasi dari alat maupun medium yang digunakan. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoclaf pada suhu 121 0 C selama 15 menit. Menurut Hadioetomo dalam Ramadhan (2012), sterilisasi
dengan menggunakan autoklaf dilakukan dengan menyimpan alat atau medium yang akan digunakan didalam autoklaf, lalu autoklaf dinyalakan hingga mencapai suhu 121ºC, setelah mencapai suhu tersebut biarkan selama 15 menit untuk membunuh kontaminan yang kemungkinan dapat mengkontaminasi alat atau medium. 3.4.4 Kultivasi Bakteri dan Pemurnian Kultivasi bakteri dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu: - Membuat medium agar kitin yang terdiri dari 2 gram koloidal kitin, 0,05 gram yeast extract, 3 gram NaCl, 0,7 gram (NH 4 ) 2 SO 4, 0,01 gram MgSO 4. 7H 2 O, 0,1 gram K 2 HPO 4, agar 2 gram. - Bahan yang sudah ditimbang kemudian dimasukan ke dalam 100 ml akuades dan dilarutkan menggunakan hot plate magnetic stirrer. - Medium disterilkan menggunakan autoclaf selama 15 menit dengan suhu 121 0 C. - Setelah suhunya menurun (± 45 0 C), medium dituangkan ke dalam cawan petri dan didiamkan hingga memadat. - Sampel diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan mikropipet. - Sampel dimasukan kedalam tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan NaCl fisiologis steril. - Melakukan pengenceran hingga 10-1, proses pengenceran disajikan pada Lampiran 4. - Sampel yang sudah diencerkan kemudian dihomogenkan dengan cara divortex. - Sebanyak 0,3 ml larutan dari hasil pengenceran diambil dengan menggunakan mikropipet - Masing-masing sampel kemudian dimasukan ke dalam cawan petri berisi medium agar kitin. - Hasil pengenceran diratakan dengan menggunakan L Glass
- Menutup cawan petri dan melapisi bagian tepinya menggunakan parafilm. - Menyimpan dalam inkubator dengan suhu 30 ºC selama 2 x24 jam. Pemurnian bakteri dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu: - Membuat medium agar kitin padat yang terdiri dari 2 gram koloidal kitin, 0,05 gram yeast extract, 3 gram NaCl, 0,7 gram (NH 4 ) 2 SO 4, 0,01 gram MgSO 4. 7H 2 O, 0,1 gram K 2 HPO 4, agar 2 gram. - Bahan yang sudah ditimbang kemudian dimasukan ke dalam 100 ml akuades dan dilarutkan menggunakan hot plate magnetic stirrer. - Medium disterilkan menggunakan autoclaf selama 15 menit dengan suhu 121 0 C. - Setelah suhunya menurun (± 45 0 C), medium dituangkan ke dalam cawan petri dan didiamkan hingga memadat. - Mengambil bakteri yang telah dikultivasi selama 2x24 jam. - Mengambil koloni bakteri yang terpisah. - Menyeleksi koloni bakteri yang akan dimurnikan berdasarkan pada bentuk, warna, dan kenampakan lainnya. - Mengambil bakteri yang akan dimurnikan menggunakan jarum ose. - Menginokulasikan bakteri yang telah diambil ke cawan petri yang berisi medium agar kitin lainnya menggunakan metode gores. - Menutup cawan petri dan melapisi bagian tepinya menggunakan parafilm. Proses tersebut diulangi hingga mendapatkan isolat murni dimana hanya terdapat bakteri yang sama dalam isolat tersebut. Proses untuk memastikan bakteri telah murni juga untuk mengetahui bakteri tersebut termasuk dalam golongan bakteri gram positif atau negatif, maka dilakukan pewarnaan dan pengamatan gram menggunakan mikroskop (Lampiran 5), dengan prosedur sebagai berikut: - Objek glass dibasahi dengan alkohol kemudian dikeringkan di atas bunsen.
- Sebanyak 1 tetes NaCl fisiologis 0,9 % diteteskan di atas objek glass. - Isolat bakteri yang akan diamati diambil menggunakan jarum ose sebanyak 1 ose. - Isolat bakteri dioleskan dengan jarum ose pada NaCl fisiologis yang terdapat pada objek glass kemudian diratakan. - Bakteri yang tercampur dengan NaCl fisiologis 0,9 % dikeringkan di atas bunsen. - Meneteskan pewarna I (gentian violet) diatas NaCl dan bakteri yang dikeringkan lalu meratakan dan mendiamkannya selama 30 detik. - Pewarna I (gentian violet) dibilas dengan menggunakan akuades kemudian dikeringkan di atas bunsen. - Meneteskan lugol kemudian meratakan dan mendiamkannya selama 30 detik. - Lugol dibilas dengan menggunakan akuades kemudian dikeringkan di atas bunsen. - Membilas dengan alkohol kemudian dikeringkan. - Membilas dengan akuades kemudian dikeringkan. - Meneteskan pewarna II (air fuchsin) lalu meratakan dan mendiamkannya selama 30 detik. - Pewarna II (air fuchsin) dibilas dengan menggunakan akuades kemudian dikeringkan di atas bunsen. - Bentuk koloni serta warna gram diamati dengan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 40x. 3.4.5 Uji Aktivitas Kitinolitik Uji aktivitas kitinolitik dilakukan pada medium agar kitin dengan tambahan koloidal kitin 0,5 gram. Pengujian aktivitas kitinolitik dilakukan dengan metode titik (Nasran et al. dalam Ilmi 2007). Pada pengujian ini dilihat zona bening yang dihasilkan. Pengujian ini dilakukan melaui beberapa tahapan, yaitu:
- Membuat medium agar kitin padat yang terdiri dari 0,5 gram koloidal kitin, 0,05 gram yeast extract, 3 gram NaCl, 0,7 gram (NH 4 ) 2 SO 4, 0,01 gram MgSO 4. 7H 2 O, 0,1 gram K 2 HPO 4. - Bahan yang sudah ditimbang kemudian dimasukan ke dalam 100 ml akuades dan dilarutkan menggunakan hot plate magnetic stirrer. - Medium disterilkan menggunakan autoklaf selama 15 menit dengan suhu 121 0 C. - Setelah suhunya menurun (±45 0 C), medium dituangkan ke dalam cawan petri dan didiamkan hingga memadat. - Sebanyak satu ose bakteri yang ada pada isolat tunggal diambil menggunakan jarum ose. - Bakteri diinokulasikan menggunakan jarum ose pada medium agar kitin dengan metode titik. - Bakteri diinkubasi selama 24 jam. - Mengamati dan mengukur luasan zona bening yang dihasilkan menggunakan jangka sorong digital. Zona bening yang terdapat pada medium merupakan respon dari bakteri terhadap koloidal kitin yang ditambahkan dalam medium. Dari seluruh isolat tunggal yang diuji aktivitas kitinolitik, diambil 2 isolat yang menghasilkan indeks kitinolitik terbesar. Menurut Gohel et al. (2006), indeks kitinolitik dihitung dengan rumus: Indeks kitinolitik = rata-rata diameter zona bening : rata-rata diameter bakteri 3.4.6 Uji Aktivitas Anti Jamur Saprolegnia sp. Pengujian bakteri kitinolitik terhadap Saprolegnia sp. terlebih dahulu dilakukan kultur jamur Saprolegnia sp (Lampiran 6) melalui beberapa tahap yaitu: - Sebanyak 3,9 gram medium PDA ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmeyer. - Sebanyak 100 ml akuades ditambahkan kedalam Erlenmeyer yang berisi medium PDA.
- Medium dilarutkan menggunakan hot plate magnetic stirrer hingga larut sempurna. - Setelah suhunya menurun (±45 0 C), serbuk khloramfenikol dimasukkan ke dalam medium kemudian medium dituangkan kedalam cawan petri dan didiamkan hingga memadat. - Saprolegnia sp. yang didapat dari ikan yang terinfeksi ditumbuhkan di tengah-tengah medium PDA. - Saprolegnia sp. diinkubasi dalam inkubator selama 2x24 jam. Proses pengujian aktivitas anti jamur Saprolegnia sp. dilakukan setelah jamur tumbuh, berdasarkan metode Elkahoui et al. (2012) melalui beberapa tahap yaitu : - Isolat bakteri kitinolitik digoreskan pada medium PDA di sekitar jamur dengan jarak 2 cm membentuk persegi yang mengelilingi jamur. - Biakan bakteri dan jamur diinkubasi pada suhu 30 0 C selama 4 hari. - Zona hambat dihitung dengan menggunakan jangka sorong digital. 3.4.7 Analisis Molekuler 16S rrna dan Fragmen Penyandi Kitinase Analisis molekuler 16S rrna dimaksudkan untuk mengidentifikasi isolat bakteri yang memiliki aktivitas kitinolitik tertinggi serta dapat menghambat pertumbuhan jamur Saprolegnia sp.. Tahapan ini meliputi: a. Persiapan bakteri menggunakan kultur cair Sebelum melakukan isolasi DNA genom bakteri kitinolitik, terlebih dahulu dilakukan kultur cair untuk perbanyakan bakteri dengan tahapan sebagai berikut: - Membuat medium nutrien broth yang diperkaya dengan koloidal kitin dengan cara menimbang sebanyak 1,3 gram nutrien broth dan 2 gram koloidal kitin. - Bahan yang sudah ditimbang kemudian dimasukan ke dalam 100 ml akuades dan dilarutkan menggunakan hot plate magnetic stirrer. - Medium disterilkan menggunakan autoclaf selama 15 menit dengan suhu 121 0 C.
- Menginokulasikan isolat bakteri yang telah dipilih untuk dilakukan analisis molekuler dalam medium nutrien broth yang diperkaya dengan koloidal kitin. - Melakukan inkubasi selama 2x24 jam dengan suhu 37 ºC, dengan kecepatan 270 rpm pada shaker incubator. b. Isolasi DNA genom bakteri Metode isolasi DNA genom bakteri yang digunakan adalah metode Quick Protocol Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega, dengan tahapan sebagai berikut: - Menyiapkan 1 ml bakteri hasil kultur cair pada tube 1,5 ml. - Sentrifugasi 13.000 rpm selama 2 menit. - Supernatan dibuang dan pelletnya yang diambil untuk isolasi - Sebanyak 480 µl 50Mm EDTA dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml. - Sebanyak120 µl lysozyme ditambahkan ke dalam tube 1,5 ml. - Inkubasi selama 30 sampai 60 menit pada suhu 37 0 C. - Sentrifugasi selama 2 menit pada 13.000 rpm dan supernatannya dibuang. - Menambahkan 600 µl nuclei lysis solution. - Inkubasi selama 5 menit pada suhu 80 0 C kemudian dinginkan pada suhu ruang. - Menambahkan 3 µl RNase solution, inkubasi pada suhu 37 0 C selama 15 sampai 60 menit. - Menambahkan 200 µl protein precipitation solution kemudian divortex. - Inkubasi on ice selama 5 menit. - Sentrifugasi 13.000 rpm selama 3 menit. - Memindahkan supernatan ke dalam tube baru yang steril dengan terlebih dahulu menambahkan 600 µl isopropanol pada tube. - Sentrifugasi pellet DNA. - Menambahkan 600 µl etanol 70 %. - Sentrifugasi selama 2 menit 13000 rpm.
- Kering udarakan selama 10 sampai 15 menit. - Menambahkan 100 µl rehydration solution kemudian diinkubasi dalam water bath dengan suhu 65 0 C selama 40 menit dan dilanjutkan dengan elektroforesis hasil isolasi DNA genom bakteri. Isolasi DNA genom bakteri disajikan pada Lampiran 7. c. Amplifikasi DNA dengan PCR Amplifikasi gen pengkode 16S rrna dilakukan dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk mendapatkan sekuen gen 16S rrna yang akan digunakan sebagai bahan sekuensing untuk menentukan jenis bakteri. Primer yang digunakan adalah primer 16S rrna universal dengan urutan nukleotida sebagai berikut: Tabel 1. Primer 16S rrna Universal Primer Urutan Nukleotida (5-3 ) Forward primer Reverse primer 27 F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492 R: GGTTACCTTGTTACGACTT Sumber : Wei Lin (2011) Amplifikasi sekuen gen 16S rrna dari DNA genom bakteri menggunakan formula reaksi PCR seperti disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. Komponen Reaksi PCR gen 16S rrna Komponen PCR Konsentrasi Akhir Volume (µl) Nuclease Free Water - 8 2x KAPA2G Fast Ready Mix 1x 12,5 Primer forward 27 F 0,5 µm 1,25
Primer reverse 1492 R 0,5 µm 1,25 DNA template - 2 Total Volume 25 Tahapan proses amplifikasi fragmen gen 16S rrna yang menggunakan reaksi campuran PCR dengan volume total 25 µl didasarkan pada pengaturan program PCR yang disajikan pada Tabel 3. Tabel 3. Pengaturan Program PCR Gen 16S rrna Siklus Suhu Waktu Jumlah Siklus Inisialisasi 95 0 C 2 menit 1 - Denaturation 95 0 C 2 menit - Annealing 55 0 C 1 menit - Extention 72 0 C 2 menit Final extention 72 0 C 7 menit 1 Final hold 4 0 C - Khusus untuk mengkopi sekuen gen penyandi enzim kitinase dari DNA genom bakteri, digunakan primer ChiE-F untuk primer forward dan Chie-R untuk primer reverse seperti yang disajikan pada Tabel 4. Tabel 4. Primer Gen Penyandi Enzim Kitinase Primer Urutan Nukleotida (5-3 ) 30 ChiE-F ChiE-R CTAGACAACTTTTTGTATAGGAGTGTTGATATG CGATTGATGAGGGCTAATTATAGTTTTACTTTG Sumber : Usharani (2010) Amplifikasi sekuen gen penyandi enzim kitinase dari DNA genom bakteri menggunakan formula reaksi PCR seperti disajikan pada Tabel 5. Tabel 5. Komponen Reaksi PCR Fragmen Penyandi Kitinase Komponen PCR Konsentrasi Akhir Volume (µl) Nuclease Free Water - 8
Go Taq Green Master Mix (Promega) Primer forward ChiE- F Primer reverse ChiE- R 1x 12,5 0,5 µm 1,25 0,5 µm 1,25 DNA template - 2 Total Volume 25 Tahapan proses amplifikasi fragmen penyandi enzim kitinase didasarkan pada pengaturan program PCR yang disajikan pada Tabel 6. Tabel 6. Pengaturan Program PCR Gen Penyandi Enzim Kitinase Siklus Suhu Waktu Jumlah Siklus Inisialisasi 94 0 C 3 menit 1 - Denaturatio 94 0 C 1 menit n 56 0 C 40 detik - Annealing 72 0 C 1 menit - Extention 32 Final extention 72 0 C 5 menit 1 Final hold 4 0 C - 1 d. Elektroforesis Elektroforesis merupakan teknik pemisahan molekular berdasarkan atas ukurannya menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul. Adapun tahapan untuk melakukan elektroforesis sebagai berikut: 1. Persiapan Elektroforesis - Sebanyak 0,4 gram gel agarose ditimbang dengan konsentrasi 1 % kemudian dimasukan kedalam botol Schott
- Sebanyak 40 ml TBE ditambahkan kedalam botol Schott. - Gel agarose dilarutkan menggunakan hot plate magnetic stirrer hingga larut sempurna. - Gel agarose yang masih cair dituangkan kedalam trays yang telah dipasang perspex (sisirnya). - Mencabut lembaran perspex yang berbentuk sisir saat gel agarose telah memadat. - Memasukan gel agarose yang telah padat ke dalam tangki elektroforesis yang berisi TBE. 2. Pengerjaan Elektroforesis - Marker dan hasil amplifikasi DNA dimasukkan pada masing-masing sumur. - Menutup tangki dan mengalirkan listrik dengan cara menyambungkan kabel-kabelnya ke stop kontak. - Sisi yang berisi hasil amplifikasi diberi arus negatif. Besarnya arus elektroforesis tidak boleh melebihi 75 volt selama 70 menit untuk elektroforesis hasil isolasi DNA genom sedangkan untuk elektroforesis hasil PCR memerlukan waktu selama 60 menit. - Setelah selesai,gel agarose direndam dalam EtBr selama 10-15 menit. - Gel agarose direndam dalam akuades steril selama 15 menit. - Setelah selesai gel agarose diangkat dengan menggunakan spatula dan ditiriskan. - Gel agarose diamati menggunakan UV transiluminator. Proses elektroforesis produk amplifikasi digunakan DNA Ladder 1 kb (Geneaid) terdiri dari fragmen mulai dari 500 sampai 10.000 bp. Amplifikasi PCR mengunakan primer 16S rrna yang memiliki daerah target amplifikasi 1.500 bp, dilanjutkan dengan amplifikasi fragmen penyandi kitinase dengan target amplifikasi 1120 bp. 3.5 Analisis Data
Setelah mendapatkan data hasil sekuensing, dilakukan analisis menggunakan perangkat bioinformatik (bioedit) dan disejajarkan sekuennya dengan data sekuen di www.ncbi.nih.nlm.gov melalui program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Program BLASTN untuk menentukan jenis dari 2 isolat terbaik yang memiliki zona bening serta dapat menghambat pertumbuhan jamur Saprolegnia sp. serta BLASTX untuk mengetahui bakteri yang memiliki gen pengkode enzim kitinase. BLAST merupakan suatu program untuk pencarian kemiripan sekuen (sequence similarity) dan merupakan alat dalam identifikasi gen dan karakter genetik. BLAST dapat melakukan pencarian sekuen melalui perbandingan dengan database DNA dalam waktu singkat (ncbi.nih.nlm.gov 2012). Program utama BLAST yaitu : - Nucleotide BLAST (BLASTN), membandingkan suatu sekuen nukleotida meragukan (query sequence) yang dimiliki dengan data base sekuen nukleotida - Protein BLAST (BLASTP), membandingkan suatu sekuen asam amino yang dimiliki dengan data base sekuen protein - BLASTX membandingkan produk translasi konsep 6-frame sebuah sekuen nukleotida (translated nucleotide) yang dimiliki dengan data base sekuen protein. - TBLASTN membandingkan suatu sekuen protein yang secara dinamis ditranslasi pada semua pembacaan 6 frame. - TBLASTX membandingkan suatu translasi 6 frame dari nukleotida. Data yang telah diperoleh dari hasil penelitian kemudian dianalisis secara deskriptif.