BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 PengertianMikrobiologi Jasad hidup yang ukurannya kecil sering disebut sebagai mikroba atau mikroorganisme atau jasad renik.jasad renik disebut sebagai mikroba bukan hanya karena ukurannya yang kecil, sehingga sukar dilihatdengan mata biasa, tetapi juga pengaturan kehidupannya yang lebih sederhana dibandingkan dengan jasad tingkat tinggi. Mata biasa tidak dapat melihat jasad yang ukurannya kurang dari 0,1 mm. Ukuran mikroba biasanya dinyatakan dalam mikron (µ), 1 mikron adalah 0,001 mm. Mikroorganisme hanya dapat dilihat dengan bantuan mikroskop dan tersebar luas di alam dan pangan. Walaupun beberapa pengaruh yang ditimbulkan oleh mikroorganisme telah diketahui dan dimanfaatkan selama ribuan tahun, tetapi baru 300 tahun yang lalu organisme mikroskopik terlihat dan dipelajari pertama kali (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, 2003). Adanya mikroba dalam kehidupan manusia di satu sisi memungkinkan kehidupan berlanjut disertai kualitas hidup yang meningkat. Hal itu disebabkan mikroba memiliki kemampuan untuk melakukan proses biokimiawi yang diperlukan bagi kehidupan manusia seperti melakukan dekomposisi bahan organik dan fermentasi yang memungkinkan dihasilkannya bahan kebutuhan manusia misalnya roti, tempe, anggur, alkohol, tape, keju, dan yogurt (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, 2003).
2.2 Pertumbuhan Mikroba Pertumbuhan mikroba mengandung arti pertambahan volume (besar) tiap individu mikroba. Pertumbuhannya sangat dipengaruhi oleh banyak faktor. Suhu mempengaruhi laju pertumbuhan, merubah proses metabolik tertentu serta morfologi (bentuk luar) sel. Kisaran suhu bagi mikroba terbagi 3 tahap yaitu suhu minimum, maksimum dan optimum. Suhu pertumbuhan optimum adalah suhu inkubasi yang memungkinkan pertumbuhan tercepat selama periode waktu yang singkat, yaitu antara 12 s/d 24 jam. Berdasarkan suhu inkubasi (kelompok fisiologi) bakteri ini, bakteri kelompok ke dalam : psikrofil (suhu 0 o -30 o C), mesofil (suhu 25 o -40 o C), termofil fakultatif (25 o -55 o C) dan termofil obligat (45 o - 75 o C) (Hasyimi, 2010). 2.3 Faktor-faktor yang MempengaruhiPertumbuhanMikroorganisme Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme,yaitu(gaman dan Sherrington, 1994): a. Waktu Laju perbanyakan bakteri bervariasi menurut spesies dan kondisi pertumbuhannya. Pada kondisi optimal, hampir semua bakteri memperbanyak diri dengan pembelahan biner sekali setiap 20 menit. Untuk beberapa bakteri, memiliki waktu generasi, yaitu selang waktu antara pembelahan, dapat mencapai 12 menit. b. Makanan Semua mikroorganisme memerlukan nutrient yang akan menyediakan: i. energi, biasanya diperoleh dari substansi mengandung pertumbuhan
ii. iii. iv. nitrogen untuk sintesis protein vitamin dan yang berkaitan dengan faktor pertumbuhan mineral c. Kelembaban Mikroorganisme, seperti halnya semua organisme memerlukan air untuk mempertahankan hidupnya. Air murni memiliki Aw = 1,0. Aktivitas air untuk hampir semua pangan segera adalah 0,99, tetapi dapat diturunkan dengan substansi terlarut seperti gula dan garam. d. Suhu Mikroorganisme dapat diklasifikasikan menjadi tiga kelompok berdasarkan suhu pertumbuhan yang diperlukannya, yaitu: i. Psikrofil (organisme yang suka dingin) dapat tumbuh baik pada suhu dibawah 20 0 C; kisaran suhu optimalnya adalah 10 0 C sampai 20 0 C. ii. Mesofil (organisme yang suka pada suhu sedang) memiliki suhu pertumbuhan optimal antara 20 0 C-45 0 C. iii. Termofil ( organisme yang suka pada suhu tinggi) dapat tumbuh baik pada suhu di atas 45 0 C. Kisaran pertumbuhan optimalnya adalah 50 0 C sampai 60 0 C. e. Oksigen Bakteri diklasifikasikan menjadi empat kelompok menurut keperluan oksigennya. i. Aerob obligat hanya dapat tumbuh jika terdapat persediaan oksigen yang banyak
ii. Aerob fakultatif tumbuh dengan baik jika oksigen cukup, tetapi juga dapat tumbuh secara anaerob iii. iv. Anaerob obligat hanya dapat tumbuh jika tidak ada oksigen Anaerob fakultatif tumbuh sangat baik jika tidak ada oksigen, tetapi mereka juga dapat tumbuh secara aerob f. ph Hampir semua mikroorganisme tumbuh baik jika ph pangan antara 6,6dan 7,5 (netral). Bakteri, terutama patogen toleransinya terhadap asam lebih kecil bila dibandingkan dengan jamur dan khamir. Tidak ada bakteri yang dapat tumbuh, jika ph di bawah 3,5. Oleh karenanya, kerusakan pangan berasam tinggi seperti buah-buahan biasanya disebabkan oleh khamir dan jamur. 2.4 Medium Pertumbuhan Mikroorganisme Medium berfungsi untuk mengisolasi, menumbuhkan mikroorganisme, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi, dan menghitung jumlah mikroba. Dalam proses pembuatan medium harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada medium (Novel dan Wulandari, 2010). 2.4.1 Jenis Medium Berdasarkan Komposisi Mediumnya Atas dasar komposisi medium antara lain terbagi atas (Novel dan Wulandari, 2010): a. Medium umum, yaitu medium semi sintetik atau alami yang mengandung nutrisi umum untuk mikroba, contohnya: nutrient broth/nb, nutrient agar/na, adalah medium umum untuk bakteri dan potatoes dextrose
agar/pda dipergunakan untuk mengkultur berbagai jenis jamur atau fungi. b. Medium diperkaya, yaitu medium sintetik yang mengandung komponenkomponen yang berasal dari makhluk hidup, seperti: darah, serum, atau ekstrak jaringan tumbuhan dan hewan. c. Medium selektif, yaitu medium sintetik yang ditambahkan zat kimia tetentu yang dapat mencegah pertumbuhan sekelompok mikroorganisme tak diinginkan tanpa menghambat pertumbuhan mikroorganisme target. Contohnya adalah brilliant green lactose bile broth (BGLBB) yang digunakan dalam penentuan bakteri koli tinja, jenis medium ini dapat menghambat pertumbuhan bakteri pemfermentasi selain bakteri coliform. d. Medium diferensial, yaitu medium yang mengandung senyawa kimia tertentu yang dapat membedakan sifat mikroorganisme tertentu dalam suatu kultur campuran dari jenis mikroorganisme lainnya karena adanya perbedaan respon terhadap senyawa kimia. Sebagai contoh adalah eosine methylene blue (EMB) yang digunakan dalam uji konfirmasi bakteri E.coli di dalam ujimost probable number (MPN) menampilkan tipe koloni yang berwarna metalik kehijauan. Sedangkan bakteri enterobacter menunjukkan warna merah muda tanpa unsur metalik. 2.4.2 Jenis Medium Berdasarkan Komposisi Bentuknya Berdasarkan bentuknya, medium terdiri atas(novel dan Wulandari, 2010): a. Medium cair b. Medium semi padat c. Medium padat
Medium padat dan semi padat adalah medium cair yang ditambahkan bahan pemadat yaitu agar. Agar merupakan ekstrak dari ganggang laut yang secara kimiawi tersusun dari karbohidrat kompleks dengan monomer galaktosa. Karena sifatnya sulit dicerna oleh enzim, tidak toksik, dan bersifat padat pada kisaran suhu 0-8 o C. Agar sangat sesuai untuk digunakan sebagai pemadat untuk digunakan sebagai bahan pemadat untuk medium tumbuh mikroorganisme. Selain itu, karena sifatnya masih berbentuk cair pada suhu 45 o C yang tidak letal terhadap kebanyakan mikroorganisme, agar dapat digunakan untuk membuat suspensi mikroorganisme. Suspensi mikroorganisme ini digunakan untuk tujuan analisis kuantitatif atau isolasi mikroorganisme. Bentuk-bentuk agar padat adalah (Novel dan Wulandari, 2010): a. Agar miring (slant agar) b. Agar diri (deep tube agar) c. Agar datar (plate agar) 2.4.3 Nutrient Agar Nutrient agar adalah medium padat untuk pertumbuhan mikroorganisme yang umum digunakan dalam berbagai kultur mikroorganisme. Ada beberapa medium agar yang ditumbuhi berbagai jenis bakteri. Beberapa bakteridapat hidup dalam media yang banyak garam dan protein di dalamnya. Namun nutrient agar adalah medium standar yang dapat ditumbuhi berbagai jenis bakteri dan merupakan cara yang baik untuk mulai belajar tentang bagaimana koloni bakteri dapat tumbuh dan menyebar (Safitri dan Novel, 2010).
Tabel 2.4.3Tipe mikroorganisme yang dikultur dengan menggunakan nutrient agar(safitri dan Novel, 2010): Mikroorganisme Pertumbuhan Escherichia coli Sangat baik Staphylococcus aureus Sangat baik Staphylococcus epidermidis Sangat baik 2.5 Bakteri Bentuk Kokus Bakteri (tunggal: bakterium) adalah kelompok mikroorganisme yang sangat penting peranannya, karena beberapa bakteri dapat menguntungkan dan merugikan. Bakteri dapat dijumpai di udara, air, tanah, usus binatang, lapisan yang lembab pada mulut, hidung atau tenggorokan, dan permukaan tubuh atau tumbuhan (Gaman dan Sherrington, 1994). 2.5.1 Genus Staphylococcus Dalam suasana anaereob, genus staphylokokus dapat mengadakan fermentasi glukosa menghasilkan asam dan lisis terhadap 200 µg lisostafin (lysostaphin). Pada keadaan aerob, dapat mengadakan fermentasi gliserol yang mengandung 0,4 µg eritromisin dengan menghasilkan gas (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, 2003). 2.5.1.1 Staphylococcus aureus S.aureus bersifat aerob atau anaerob fakultatif, tes katalase positif dan tahan hidup dalam lingkungan yang mengandung garam dengan konsentrasi tinggi (halofilik), misalnya NaCl 10%. Untuk membiakkan staphylokokus diperlukan suhu optimal antara 28-38 o C, atau sekitar 35 o C. Apabila bakteri tersebut diisolasi
dari seorang penderita, suhu optimal yang diperlukan adalah 37 o C. ph optimal untuk pertumbuhan s.aureus adalah 7,4. Pada umumnya staphylokokus dapat tumbuh pada medium-medium yang biasa dipakai di laboratorium bakteriologi salah satunya adalah:nutrient agar plate (NAP), medium ini penting untuk mengetahui adanya pembentukan koloni s.aureus yang ditandai dengan terbentuknya pigmen berwarna kuning emas. Koloni yang tumbuh berbentuk bulat, berdiameter 1-2mm, konveks dengan tepi rata, permukaan mengkilat dan konsistensinya lunak, pada umumnyauntuk membiakkan staphylococcus aureus, perlu medium yang mengandung asam amino dan vitamin-vitamin, misalnya: threonin, asam nikotinat, dan biotin (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, 2003) 2.5.1.2 Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis secara mikroskopis morfologinya tidak dapat dibedakan dengan staphylococcus aureus. Koloninya bulat, halus pada umumnya tidak menghasilkan pigmen dan warnanya putih pucat. Perbedaan dengan Staphylococus aureus adalah pada bakteri ini memberikan hasil negatif pada tes koagulase, demikian juga untuk tes DNAse dan fermentasi manitol (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, 2003) 2.5.2 Genus Eschericia 2.5.2.1 Genus Eschericia coli E.colilebih sering digunakan sebagai objek dalam penelitian ilmiah dibandingkan denganmikroorganisme yang lain. Organisme ini merupakan penghuni utama di usus besar, dan juga merupakan isolat penyebab utama infeksi
saluran kemih dan luka infeksi, pneumonia, meningitis, serta septisemia (Tim Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, 2003). 2.6 Teknik Penanaman (Inokulasi) 2.6.1 Penanaman Pada Media Padat Berbentuk Plate Metode tuang (pour plate) dari pengenceran yang dikehendaki, sebanyak 1 mlatau 0,1 ml larutan tersebut dipipet ke dalam cawan petri menggunakan pipet 1mL atau 1,1 ml. Sebaiknya waktu antara dimulainya pengenceran sampai menuangkan ke dalam cawan petri tidak boleh lebih lama dari 30 menit (Fardiaz, 1993). Segera setelah penuangan, cawan petri digerakkan di atas meja secara perlahan untuk menyebarkan sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakan melingkar atau seperti angka delapan, setelah agar memadat, cawan tersebut dapat diinkubasikan di dalam inkubator dengan posisi terbalik (Fardiaz, 1993). Inkubasi dilakukan pada suhu dan waktu tertentu sesuai dengan jenis mikroba yang akan dihitung. Medium agar yang digunakan juga disesuaikan dengan jenis mikroba yang akan ditumbuhkan. Selama inkubasi, sel-sel yang masih hidup akan tumbuh dan membentuk koloni yang dapat terlihat langsung oleh mata (Fardiaz, 1993). Setelah diinkubasi, koloni baik yang tumbuh dalam agar atau pada permukaan agar dihitung. Prosedur ini termasuk yang paling peka, sampai sejumlah 20 sel/ml dapat dihitung. Metode ini tidak dapat diterapkan dalam studi lapangan karena dibutuhkan alat-alat untuk mencairkan dan mendinginkan media agar (Buckle, Hari dan Adiono 1985).
Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45 o C) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu dihomogenkan dan biarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan terendam (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan yang kaya O 2 dan ada yang tumbuh tidak begitu banyak mengandung oksigen (Novel dan Wulandari, 2010). 2.7 Pencucian Alat-alat Makan Semua peralatan makan sebaiknya dicuci dengan air yang mengandung deterjen. Deterjen berfungsi menurunkan tegangan permukaan air sehingga seluruh permukaan alat makan menjadi bersih. Deterjen sebagai pengemulsi yang baik untuk mempertahankan kotoran dalam bentuk suspensi, sehingga lemak dan kotoran tidak membentuk scum (kotoran yang mengapung). Deterjen tidak boleh bersifat toksin, secara kimiawi stabil dan mudah di hilangkan dengan air bersih suhu 63 o C. Pada suhu tersebut hampir semua kotoran dan lemak dapat dihilangkan. Jika suhunya lebih tinggi 100 o C, protein akan kembali menempel pada peralatan dan ini tidak dikehendaki (Gaman dan Sherrington, 1994). Dalam setiap proses pembersihan alat makan, bahan sanitasi yang digunakan harus mengikuti prosedur umum berikut (Buckle, Hari dan Adiono 1985): 1. Alat makan dicuci sebaik mungkin sehingga tidak ada sisa organik yang tampak oleh mata. Pencucian ini dapat dibantu dengan menggunakan deterjen dan apabila bahan ini digunakan harus dibasuh/dibilas secara baik dengan air bersih.
2. Lakukan sanitasi. Beberapa contoh dari keadaan sanitasi termasuk menyiram dengan air panas 80 o C selama ½ - 1 menit, 2.7.1 Peralatan 1) Peralatan yang kontak dengan makanan a) Peralatan masak dan peralatan makan harus terbuat dari bahan tarapangan (food grade) yaitu peralatan yang aman dan tidak berbahayabagi kesehatan. b) Lapisan permukaan peralatan tidak larut dalam suasana asam/basa atau garam yang lazim terdapat dalam makanan dan tidak mengeluarkan bahan berbahaya dan logam berat beracun seperti : (1) timah hitam (Pb) (2) arsenikum (As) (3) tembaga (Cu) (4) seng (Zn) (5) cadmium (Cd) (6) antimon (Stibium) (7) dan lain-lain c) Talenan terbuat dari bahan selain kayu, kuat dan tidak melepas bahan beracun. d) Perlengkapan pengolahan seperti kompor, tabung gas, lampu, kipas angin harus bersih, kuat dan berfungsi dengan baik, tidak menjadi sumber pencemaran dan tidak menyebabkan sumber bencana (kecelakaan) (Permenkes, 2011). 2) Wadah penyimpanan makanan Adapun wadah penyimpanan alat makan yang baik adalah sebagai berikut(permenkes, 2011):
a. Wadah yang digunakan harus mempunyai tutup yang dapat menutup sempurna dan dapat mengeluarkan udara panas dari makanan untuk mencegah pengembunan (kondensasi). b. Terpisah untuk setiap jenis makanan, makanan jadi/masak serta makanan basah dan kering. c. Peralatan bersih yang siap pakai tidak boleh dipegang di bagian yang kontak langsung dengan makanan atau yang menempel di mulut. d. Kebersihan peralatan harus tidak ada kuman eschericia coli (E.coli) dan kuman lainnya. Selama proses pembersihan, alat sebaiknya disterilkan. Sterilisasi dapat dicapai dengan penggunaan panas maupun bahan kimia. Pada mesin pencuci piring, peralatan disterilkan dengan panas (Gaman dan Sherrington, 1994). Jika pencucian dilakukan dengan tangan, harus digunakan sekurangkurangnya dua bak pencelup. Bak pencelupan pertama berisi air pencuci dengan deterjen dan bak pencelup kedua berisi air pembilas. Suhu air pembilas sebaiknya antara 77 o C dan 100 o C. Piring-piring harus direndam dalam air pembilas dapat sampai dua menit, tergantung pada suhu air yang dipakai. Bak pencelupan ketiga yang beirisi air dingin dan desinfektan dianjurkan untuk dipakai (Gaman dan Sherrington, 1994). Proses pembilasan memiliki dua fungsi: menghilangkan semua bekas deterjen dan desinfektan serta membunuh sembarang bakteri yang mungkin berada pada alat. Suhu harus cukup tinggi untuk memungkinkan alat menjadi kering angin, tanpa perlu penggunaan kain lap. Kain lap merupakan tempat
mikroorganisme yang berbahaya, yang dapat memindahkannya dari satu alat ke alat yang lain (Gaman dan Sherrington, 1994). 2.8 HitunganCawan Penghitungan bakteri dapat pula dilakukan dengan penjumlahan koloni pada cawan, karena suatu sel hidup dipermukaan medium agar akan tumbuh, dan membentuk koloni yang secara makroskopis dapat dilihat. Cara penghitungan ini disebut penjumlahan sel hidup, berbeda dengan penjumlahan mikroskopik langsung dan penghitungan dengan alat elektronik, cara itu hanya mengukur selsel yang dapat tumbuh pada medium dalam cawan yang dipergunakan. Penjumlahan sel hidup merupakan metode yang paling peka untuk menaksir jumlah bakteri, karena satu sel pun yang hidup di dalam suspense itu dapat diketahui (Stanier dan Adelberg, 1984). Prinsip dari metode hitungan cawan adalah jika sel jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel jasad renik tersebut akan berkembangbiak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan di hitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitive untuk menentukan jumlah jasad renik karena (Fardiaz, 1993): a. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung b. Beberapa jenis jasad renik dapat dihitung sekaligus
c. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi jasad renik karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu jasad renik yang mempunyai penampakan pertumbuhan spesifik Selain keuntungan-keuntungan tersebut, metode hitungan cawan juga mempunyai kelemahan-kelemahan sebagai berikut (Fardiaz, 1993): a. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni. b. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda. c. Jasad renik yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar. d. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relative lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung. Hal yang paling sering dan banyak digunakan adalah prosedur perhitungan dengan penumbuhan dalam agar. Secara sederhana suatu contoh suspensi sel atau bahan pangan homongen diinokulasi ke dalam atau ke atas media nutrient agar dan setelah diinkubasi, jumlah koloni yang terbentuk dihitung. Keuntungan lain adalah kemungkinan untuk mengetahui berbagai jenis organisme yang berada dalam contoh dari perbedaan bentuk koloni yang tumbuh dan kemungkinan mengisolasi tipe koloni yang paling dominan untuk identifikasi taksonomi (Buckle,Hari dan Adiono 1985).
2.9 Standar Perhitungan Perhitungan suatu hasil analisis mikrobiologi digunakan standar yang disebut standard plate count (SPC), yang menjelaskan cara memilih data yang ada untuk menghitung jumlah koloni di dalam suatu contoh. Cara menghitung koloni pada cawan adalah sebagai berikut (Fardiaz, 1993): 1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 dan 300 2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloni nya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni 3. Suatu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni