DETEKSI KARBOHIDRAT NETRAL PADA OVARIUM DAN UTERUS TIKUS PUTIH DENGAN PEWARNAAN PERIODIC ACID SCHIFF (PAS) (Detection of Neutral Carbohydrates in The Ovary and Uterus of White Rat with Periodic Acid Schiff Staining) Safrida Laboratorium Pendidikan Biologi Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Syiah Kuala Email: idabiologi@yahoo.co.id Abstrak Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi karbohidrat netral atau mukopolisakarida dalam ovarium dan uterus tikus dengan pewarnaan Asam Schiff Periodik (PAS). Sediaan histologi menggunakan metode Kiernan. Respon komponen dari sel atau jaringan ovarium dan rahim untuk pewarnaan Asam Schiff periodik ditunjukkan dengan warna merah atau magenta pada sitoplasma, dan warna biru atau ungu di dalam inti sel. Sediaan histologi dari jaringan ovarium dengan pewarnaan PAS tidak ada kandungan karbohidrat netral atau kandungan karbohidrat netral sangat kecil. Sediaan histologis jaringan rahim dengan pewarnaan PAS ada kandungan karbohidrat netral dalam sitoplasma sel-sel endometrium rahim. Kata kunci: Karbohidrat Netral, Periodic Acid Schiff, pewarnaan, Ovarium, Rahim, Rattus norvegicus Abstract This study aimed to detect the neutral carbohydrates or mucopolysaccharide in the ovaries and uterus of rat with Periodic Acid Schiff (PAS) staining. Histological preparations using the method of Kiernan. Response components of the cell or tissue ovaries and uterus to staining Periodic Acid Schiff staining is shown by the red or magenta color of the cytoplasm, and the blue or purple color in the cell nucleus. Histological preparations of ovarian tissue with PAS staining there is no neutral carbohydrate content or neutral carbohydrate content is very small. Histological preparations uterine tissue with PAS staining there is neutral carbohydrates in the cytoplasm of cells of the uterine endometrium Key words: Neutral carbohydrate, Periodic Acid Schiff, staining, Ovaries, Uterus, Rattus norvegicus PENDAHULUAN Histoteknik atau teknik histologi merupakan ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah. Sedangkan teknik histokimia merupakan teknik untuk mendeteksi keberadaan komponen-komponen yang terdapat dalam struktur jaringan atau sel seperti protein, lemak, karbohidrat, hormon ataupun enzim (Gunarso 1989). Pengetahuan tentang histoteknik sangat diperlukan mengingat sifatnya yang mampu menunjang berbagai bidang ilmu seperti Biologi Sel, Embriologi, Anatomi, Fisiologi, Histologi dan lain-lain. Perkembangan pengetahuan kita tentang anatomi mikroskopis baik hewan maupun tumbuhan banyak diperoleh dari hasil telaah spesimen mikroteknik atau yang dikenal sebagai spesimen histologi. Biasanya spesimen merupakan bagian yang sangat kecil dari suatu organisme, namun organisme secara keseluruhan dapat pula merupakan suatu spesimen bila organisme tersebut cukup kecil untuk diamati dengan mikroskop. Sajian histologi yang dibuat harus dapat memberikan gambaran tentang bentuk dan besar serta susunan sel; inti sel dan sitoplasma; badan inklusi (glikogen, tetesan lemak, pigmen dan sebagainya); susunan serat jaringan ikat; otot dan lain sebagainya sesuai dengan gambaran jaringan tubuh tersebut dalam kondisi hidup. Sajian yang baik dapat membantu dalam memahami struktur histologi jaringan tubuh sesuai dengan kondisi yang sebenarnya pada waktu hidup. Sajian yang baik juga akan memberikan hasil yang benar-benar shahih (valid/akurat) yang sangat dibutuhkan oleh para peneliti untuk menjawab permasalahan yang timbul. Di samping itu sajian yang baik juga diperlukan oleh klinikus untuk menunjang diagnosa penyakit yang diderita oleh pasien (Jusuf 2009).
Safrida, Deteksi Karbohidrat Netral pada Ovarium dan Uterus Tikus Putih dengan Pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) Proses pewarnaan berfungsi untuk melindungi jaringan dari berbagai macam faktor yang bersifat merusak jaringan, seperti fisik, kimia maupun biologi. Pewarna adalah senyawa berwarna yang dapat berikatan dengan substrat dan digunakan untuk mempelajari morfologi, struktur dan berbagai komponen jaringan melalui proses pewarnaan. Pewarnaan ada dua jenis yaitu pewarnaan umum dan pewarnaan khusus. Salah satu pewarnaan khusus, yaitu pewarnaan dengan menggunakan Periodic Acid Schiff (PAS ) (Kiernan 1990). Pewarnaan PAS digunakan untuk mendeteksi mukopolisakarida yang bersifat netral dengan cara pemutusan ikatan pada gugus 1,2 glikol oleh asam periodat dan mengoksidasinya menjadi gugus aldehid. Gugus aldehid ini selanjutnya berikatan dengan pereaksi Shiff (tidak berwarna) menjadi berwarna merah muda atau magenta (Kiernan, 1990). Karbohidrat dapat ditemukan di seluruh tubuh. Senyawa ini terutama ditemukan di permukaan sel, di dalam sitoplasma dan di matriks ekstrasel. Karbohidrat berperan penting dalam proses metabolisme, respons imun, differensiasi, migrasi sel, maturasi sel, dan proses interaksi antar sel (Bancroft 1967; Kurohmaru dan Hayashi 1998). Karbohidrat kompleks atau yang sering disebut sebagai glikokonjugat dibagi menjadi dua kelompok yaitu karbohidrat asam dan karbohidrat netral. METODE Bahan dan Alat Sampel organ yang digunakan dalam penelitian ini adalah ovarium, uterus, dari tikus putih (Rattus norvegicus) betina yang berasal dari galur Sprague-Dawley berumur 6 bulan. Bahan lain yang digunakan adalah larutan Bouin untuk pengawetan jaringan, alkohol, silol, paraffin, 0,9% NaCl fisiologis, hidrogen peroksida (H 2O 2), metanol, Reagens periodic acid Schiff (PAS), tris buffer, 0,01 M phosphate buffer saline (PBS) ph 7,4, medium perekat entellan dan akuades Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah satu set alat bedah, gelas piala, gelas ukur, gelas obyek, gelas penutup, kotak lembab, mikrotom, mikropipet, inkubator dan mikroskop cahaya yang dilengkapi kamera. Pembuatan Preparat Histologi Hewan dikorbankan dengan cara dibius atau dislokasi leher. Segera setelah hewan mati organ ovarium dan uterus yang akan digunakan untuk preparat histologis diambil. Organ tersebut dicuci dengan 0,9% NaCl fisiologis dimasukkan dalam larutan fiksatif Bouin (dengan komposisi Perbedaan antara karbohidrat asam dan karbohidrat netral yaitu terletak pada ada tidaknya gugus asam. Gugus asam terdapat pada kelompok karbohidrat asam, sedangkan karbohidrat netral tidak memiliki gugus tersebut (Bancroft 1967; Dellmann and Brown 1993). Ovarium dan uterus merupakan organ reproduksi pada hewan betina. Ovarium mempunyai fungsi ganda yaitu menghasilkan serta melepaskan (ovulasi) oosit dan menghasilkan serta mensekresi hormon-hormon. Korteks ovari terdiri atas stroma jaringan ikat yang mengandung banyak sel-sel, di dalamnya terbenam folikel-folikel ovarium. Uterus adalah organ dimana fetus berkembang dan mendapat nutrisi sampai lahir. Dinding uterus terdiri atas suatu mukosa yang disebut endometrium. Disekelilingi oleh lapisan otot polos miometrium yang membentuk hampir seluruh ketebalan dinding dan akhirnya membran serosa luar peritoneum, yang menutupi uterus disebut perimetrium (Geneser 1994). Tujuan penelitian ini untuk mendeteksi karbohidrat yang bersifat netral atau mukopolisakarida pada ovarium dan uterus tikus dengan pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS). asam pikrat jenuh : formalin pro-analisis : asam asetat glacial = 15:5:1) selama 24 jam. Setelah organ terfiksasi larutan diganti dengan alkohol 70% yang dikenal sebagai stopping point dengan pengertian jaringan dapat disimpan lama pada larutan ini. Dalam stopping point, jaringan dapat disimpan dalam waktu yang lama atau tidak terbatas namun perlu disertai dengan penggantian alkohol 70% secara regular dengan yang baru misalnya setiap dua minggu atau sebulan sekali. Proses penarikan air dari jaringan (dehidrasi) dilakukan menggunakan alkohol dengan konsentrasi bertingkat mulai 80% sampai dengan 100% dan dijernihkan dengan silol (clearing) sebelum akhirnya ditanam dalam parafin (embedding). Jaringan dalam blok parafin disayat secara serial menggunakan mikrotom rotary dengan ketebalan 5 μm, dilekatkan pada gelas obyek yang telah dilapisi dengan alkohol 70%, kemudian disimpan dalam inkubator 40 0 C selama 24 jam. Sediaan kemudian diwarnai dengan pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS).
Jurnal Ilmiah Pendidikan Biologi, Biologi Edukasi Volume 4, Nomor 1, Juni 2012, hlm 36-40 Prosedur Pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) Pewarnaan ini akan mewarnai inti dan sitoplasma, dimana inti akan terwarnai biru dan sitoplasma akan terwarnai merah. Tahapan prosedur pewarnaan PAS adalah sebagai berikut: 1. Deparafinasi (silol III, II, I), air mengalir, DW (diionized water) atau aquades dengan waktu sesuai prosedur 2. Oksidasi dalam larutan 0,5 1% periodic acid dengan RT (retention time) selama 5 menit 3. DW satu kali dengan RT 5 menit 4. DDW (aquabides) dengan RT 2 x @ 5 menit HASIL DAN PEMBAHASAN A. Ovarium Pewarnaan PAS digunakan untuk mendeteksi mukopolisakarida atau karbohidrat yang bersifat netral dalam bentuk glikokonjugat dengan cara memutus ikatan pada gugus 1,2 glikol oleh asam periodat dan mengoksidasinya menjadi gugus aldehid. Gugus aldehid ini selanjutnya berikatan dengan pereaksi Shiff (tidak berwarna) menjadi berwarna magenta atau merah muda (Kiernan, 1990). Pewarnaan periodic acid Schiff (PAS) terhadap sediaan histologis ovarium (Gambar 1) menunjukkan bahwa tidak munculnya warna merah magenta pada sitoplasma sel-sel granulosa dan sitoplasma oosit jaringan tersebut. Hal ini di duga dalam sitoplasma jaringan tersebut tidak terdapat kandungan karbohidrat netral atau kandungan karbohidrat netralnya sangat sedikit sehingga tidak terdeteksi denga pewarnaan PAS. Sedangkan warna ungu/biru pada inti sel-sel granulosa disebabkan oleh counterstain hematoksilin B. Uterus Gambaran mikroskopis sel-sel uterus hasil pewarnaan PAS dapat dilihat pada Gambar 2. Pewarnaan menggunakan periodic acid Schiff (PAS) (Gambar 2) memperlihatkan preparat histologis uterus dengan sitoplasmanya berwarna merah keunguan/magenta,dan pada bagian inti sel berwarna ungu/biru. Hal ini menunjukkan adanya reaksi antara gugus aldehid hasil oksidasi dari gugus 1,2 glikol karbohidrat netral dengan reagens Schiff yang memunculkan warna merah keunguan/magenta dalam sitoplasma sel-sel endometrium uterus walaupun tampak warna merahnya pudar. Beberapa jenis karbohidrat netral yang menyumbangkan gugus aldehid melalui proses oksidasi dan mampu bereaksi dengan reagen Schiff, antara lain amilase, glikogen, lipofukhsin, glikoprotein dan 5. Schif reagens dengan RT 15 menit 6. Air sulfit (selalu dibuat baru) dengan RT 3 x @ 3 menit 7. DW dengan RT 3 x @ 5 menit 8. Counterstain (misalnya: mayer hematoksilin) dan dilakukan cek preparat dengan mikroskop 9. Air mengalir selama 10-60 menit 10. DW dengan RT 2 x @ 5 menit 11. Dehidrasi (90%, alkohol absolut I, II, III), clearing (silol I, II, III), dan mountin glikolipid. Dengan munculnya warna merah keunguan/magenta, diduga sel-sel endometrium uterus mengandung karbohidrat netral dari beberapa jenis tersebut. Warna ungu/biru pada inti sel-sel uterus disebabkan oleh counterstain hematoksilin. Hal ini sesuai dengan penelitian Eric et al. (2008) pewarnaan PAS terhadap sediaan histologis sel-sel uterus fetal monyet menunjukkan adanya sejumlah glikogen dalam sitoplasma sel epitel kelenjar endometrium. SIMPULAN Pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) dapat mendeteksi adanya senyawa mukopolisakarida (karbohidrat netral) dalam sitoplasma, permukaan membran sel dan matriks ekstrasel. Respons komponen sel/jaringan terhadap pewarnaan PAS ditunjukkan oleh sitoplasmanya berwarna merah keunguan/magenta, dan pada bagian inti sel berwarna ungu/biru. Jaringan ovarium yang diwarnai dengan pewarnaan PAS tidak terdapat kandungan karbohidrat netral atau kandungan karbohidrat netralnya sangat sedikit. Jaringan uterus yang diwarnai dengan pewarnaan PAS terdapat senyawa karbohidrat netral pada sitoplasma sel-sel endometrium uterus.
Safrida, Deteksi Karbohidrat Netral pada Ovarium dan Uterus Tikus Putih dengan Pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) a b 1 2 3 Gambar 1. Fotomikrograf preparat histologis jaringan ovarium dengan menggunakan pewarnaan PAS. (a) Perbesaran 200x bagian folikel sekunder; (b) Perbesaran 200x bagian folikel tersier awal. Skala bar : 100 mikron. Respons negatif terhadap pewarnaan PAS. Keterangan gambar: 1. Sel-sel granulosa pada folikel sekunder. 2. Nukleus pada folikel sekunder. 3. Sitoplasma oosit folikel tersier awal. 2 1 3 Gambar 2. Fotomikrograf preparat histologis jaringan uterus dengan menggunakan pewarnaan PAS. (a) Perbesaran 200x; (b) Perbesaran 400x. Skala bar : 30 mikron. Respons positif terhadap pewarnaan PAS akan menghasilkan warna merah muda/magenta pada sitoplasma dan warna ungu/biru pada inti sel. Keterangan gambar: 1. Endometrium, 2. Kelenjar endometrium, 3. Rongga uterus.
Jurnal Ilmiah Pendidikan Biologi, Biologi Edukasi Volume 4, Nomor 1, Juni 2012, hlm 36-40 DAFTAR PUSTAKA Bancroft, JD. 1967. An Introduction to Histochemical Technique. Appleton Century Crofts. London. 62-63 Dellmann, HD and Brown EM. 1993. Textbook of Veterinary Histology. 4 th edition. Lea and Febiger. Philadelphia. Pp. 153-165 Eric van Esch, J. Mark Cline, Eberhard Buse and Gerhard F. Weinbauer. 2008. The Macaque Endometrium, with Special Reference to the Cynomolgus Monkey (Macaca fascicularis). J.Toxicol Pathol.vol. 36 no. 7 suppl 67S-100S Geneser F. 1994. Textbook of Histology (Buku Teks Histologi), Jilid 2. Terjemahan. Alih Bahasa: Arifin Gunawijaya. Jakarta: Binarupa Aksara. Gunarso, W. 1989. Mikroteknik. Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat, Institut Pertanian Bogor. Jusuf AA. 2009. Histoteknik Dasar. Bagian Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia Kiernan, JA. 1990. Histological and Histochemiscal Method. 2 nd Edition. Pergamon Press, England Kurohmaru, M, Hayashi Y. 1998. Lectin Binding Status of The Testis in Some Animals. In Reproductive Biology Update-Novel Tools for Assessment of Environmental Toxicity. Nakanishi Printing Co., Kyoto