ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT DARI FESES BAYI DAN EVALUASI IN VITRO POTENSI PROBIOTIK 1. Widodo, S.P., M.Sc., Ph.D. 2. Prof. drh. Widya Asmara, S.U., Ph.D. 3. Tiyas Tono Taufiq, S.Pt, M.Biotech
Latar Belakang Penelitian Manfaat Didominasi bagi kesehatan produk probiotik Pangan fungsional Pengetahuan konsumen Jaminan Memanfaatkan keamanan pangan kultur probiotik 1. Bakteri Peningkatan hidup yang kesehatan apabila saluran dikonsumsi pencernaan. dalam jumlah cukup 2. Menurunkan dapat memberikan gejala lactose pengaruh intolerance. kesehatan bagi inangnya 3. Menurunkan aktivitas bakteri yang bersifat merugikan. 4. Merangsang sistem kekebalan saluran pencernaan.
Mikrobiota saluran pencernaan
Bakteri asam laktat (BAL) Bakteri non patogen dan termasuk ke dalam kelompok bakteri yang memiliki status Generally Recognized as Safe (GRAS) (1) Menurut produk akhir metabolisme dapat dibagi menjadi dua kategori umum: homofermentatif dan heterofermentatif (2) Menghasilkan sejumlah faktor antibakteri: asam organik, hidrogen peroksida, CO 2 dan bakteriosin (3)
Probiotik Bakteri hidup yang apabila dikonsumsi dalam jumlah cukup dapat memberikan pengaruh kesehatan pada inang (4) Terutama berasal dari genus Lactobacillus dan Bifidobacterium. Prasyarat bakteri probiotik (5): resisten terhadap ph yang rendah toleran terhadap asam empedu mampu menempel pada sel mukosa saluran pencernaan dapat memberikan bukti klinis manfaatnya dapat memfermentasi oligosakarida
Tujuan Penelitian 1. Mengisolasi BAL dari feses bayi. 2. Mengidentifikasi isolat BAL yang memiliki potensi sebagai probiotik in vitro. 3. Mengetahui kemampuan isolat dalam memanfaatkan prebiotik inulin sebagai sumber karbon.
Hipotesis Bakteri asam laktat dapat diisolasi dari feses bayi yang mengkonsumsi ASI eksklusif. Bakteri asam laktat yang diisolasi dari feses bayi yang mengkonsumsi ASI eksklusif memiliki potensi sebagai probiotik dan mampu memanfaatkan prebiotik sebagai sumber karbon.
Flow Chart Isolasi Identifikasi fenotip Identifikasi genotip Uji potensi probiotik Pengambilan sampel Inokulasi Pengecatan Gram Inkubasi Uji pembentukan CO 2 dari glukosa Pemurnian Ekstraksi DNA dan seleksi Uji pertumbuhan Pembuatan Amplifikasi gen kultur 16S stok rrna Uji Ketahanan katalase, terhadap motilitas, ph spora 2,0 Elektroforesis dan visualisasi Ketahanan terhadap garam empedu Sekuensing (Metode dideoksi) Aktivitas penghambatan patogen Kemampuan penempelan Pertumbuhan pada prebiotik inulin
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
No. Kode Isolat Gram Identifikasi fenotip Bentuk CO 2 dari glukosa Pertumbuhan 10ºC 45ºC Katalase Motilitas 1 1AA + Batang - + - - - - 2 1AB + Batang + + + - - - 3 1AC + Batang - + + - - - 4 1AD + Kokus - + - - - - 5 1AE + Batang - + - - - - 6 1AF + Batang - + - - - - 7 1AG + Batang - - + - - - 8 1AH + Batang + + + - - - 9 1AI + Batang - - - - - - 10 1AK + Batang + + - - - - 11 1AL + Batang - - - - - - 12 1AN + Batang - + + - - - 13 1BE + Kokus - + - - - - 14 1BH + Kokus - + - - - - 15 1BK + Kokus - + - - - - 16 1BL + Kokus - - + - - - 17 1A7 1B7 1 + Kokus - - - - - - Spora
Amplifikasi M 1B7 1AF 1AL 1AA Gambar 4. Visualisasi hasil PCR pada marker 100 bp
Identifikasi genotip Sekuen parsial gen16s rrna isolat 1AF: Gambar 5. Sekuens isolat IAF
Pohon filogeni Lactobacillus casei strain 41-189 Lactococcus lactis Lactobacillus paracasei subsp. paracasei strain 28-140 Lactobacillus casei strain Lc18 Lactobacillus casei strain: Shirota Lactobacillus casei strain KH-1 Isolat 1AF 1st Base Lactobacillus casei strain: YIT 0209 ( NCDO 151) Lactobacillus casei strain 29-147 Lactobacillus casei strain ZJ3 Lactobacillus casei strain J026 Lactobacillus acidophilus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strain: JCM 1002 Bifidobacterium bifidum DSM 20456 0.02 Gambar 6. Dendogram neighbour joining isolat 1AF
Ketahanan terhadap ph rendah Tabel 1. Viabilitas isolat L.casei 1AF terhadap inkubasi ph 2,0 Waktu (menit) Jumlah (Log 10 cfu/ml) 0 8,67 ± 0,06 a 30 7,16 ± 0,10 b 60 6,28 ± 0,17 c 90 5,24 ± 0,15 d Terjadi penurunan signifikan hingga 3 log 10 setelah inkubasi pada ph 2,0 selama 90 menit.
Ketahanan terhadap ph rendah Tabel 2. Viabilitas isolat L.casei 1AF terhadap terhadap gradien ph 2 8 ph Jumlah (Log 10 cfu/ml) 2,0 4,82 ± 0,42 3,0 5,18 ± 0,02 4,0 6,29 ± 0,29 5,0 7,53 ± 0,22 6,0 8,37 ± 0,05 6,2 8,50 ± 0,07 7,0 8,32 ± 0,18 8,0 6,31 ± 0,28
Ketahanan terhadap garam empedu Tabel 3. Viabilitas isolat L.casei 1AF terhadap 0,5% ox bile Perlakuan Jumlah (Log 10 cfu/ml) MRS normal 8,50 ± 0,07 MRS + ox bile 6,74 ± 0,04 Terjadi penurunan sekitar 2 log 10 setelah inkubasi pada media dengan 0,5% ox bile.
Kemampuan penghambatan terhadap patogen Tabel 4. Kemampuan L.casei 1AF dalam penghambatan patogen Perlakuan Diameter zona hambat (mm) Escherichia coli 12,00 ± 1,00 Bacillus cereus 15,33 ± 1,53 Isolat L. casei 1AF memiliki kemampuan penghambatan terhadap bakteri patogen. Penghambatan terhadap patogen terjadi karena penurunan ph akibat metabolisme heksosa oleh isolat L. casei 1AF.
Kemampuan penempelan bakteri Tabel 5. Penempelan pada permukaan padat Isolat Jumlah (koloni/ml) L. Casei 1AF 9.367 ± 1.721,43 Isolat L. casei 1AF mampu membentuk biofilm pada permukaan padat.
0.00 1.50 3.00 4.50 6.00 7.50 9.00 10.50 12.00 13.50 15.00 16.50 18.00 19.50 21.00 22.50 24.00 25.50 27.00 28.50 30.00 Absorbansi Pertumbuhan pada glukosa, sukrosa, dan laktosa 1.600 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 MRS Glukosa Laktosa Sukrosa 0.200 0.000 Waktu (jam)
0.00 1.50 3.00 4.50 6.00 7.50 9.00 10.50 12.00 13.50 15.00 16.50 18.00 19.50 21.00 22.50 24.00 25.50 27.00 28.50 30.00 Absorbansi Pertumbuhan pada inulin 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 Glukosa Inulin 0.200 0.000 Waktu (jam)
Inulin sebagai sumber karbon Inulin dapat dihidrolisis oleh L. casei 1AF. Laju pertumbuhan isolat pada inulin rendah dibandingkan dengan glukosa sebagai sumber karbon. Hidrolisis inulin oleh probiotik telah diteliti oleh Rossi et al. (6) yang menyebutkan peranan enzim β-fruktofuranosidase ekstraseluler.
Kesimpulan Isolat Lactobacillus casei 1AF memiliki potensi in vitro sebagai probiotik. Isolat tersebut mampu memanfaatkan inulin sebagai satu-satunya sumber karbon. Enzim spesifik yang berperan dalam hidrolisis inulin oleh genus Lactobacillus belum karakterisasi secara lengkap.
Saran Perlu dilakukan analisis lanjutan potensi isolat sebagai probiotik untuk mencapai status GRAS. Sumber alternatif inulin dapat dicobakan misalnya inulin dari umbi Dahlia. Isolat yang disimpan dapat dimanfaatkan untuk analisis aspek fungsional lain, misalnya produksi conjugated linoleic acid.