14 METODOLOGI PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Tempat penelitian dilakukan di Laboratorium Unit Pelayanan Mikrobiologi Terpadu, Bagian Mikrobiologi Kesehatan, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan masyarakat veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan dan Kandang terpadu Kampus IPB Dramaga, Bogor. Penelitian dilakukan mulai dari Bulan September November 2011 Bahan dan Alat Penelitian Ayam pedaging umur sehari (DOC) beserta pakan, vaksin IBD Blend M galur intermediate komersial, Virus IBD isolat lapang (Balitvet), ELISA kit IBD (Biocheck), RNEasy Protect Mini Kit QIAGEN, Access quick RT-PCR System (PROMEGA), Plat ELISA dan ELISA Reader Metode Penelitian Hewan coba. Seratus enam puluh ekor DOC digunakan pada penelitian ini. Sebanyak dua puluh ekor DOC ditimbang dan diambil sampel darahnya. Ayam dimatikan dan diambil organ BFnya ditimbang dan diamati kondisinya. Selanjutnya sisa ayam sebanyak 140 ekor dibagi menjadi empat kelompok dengan 35 ekor setiap kelompoknya. Pembagian kelompok ayam percobaan dilakukan secara random (Tabel 1). Kelompok Percobaan dan Vaksinasi. Kelompok K1, K2, dan K3 diberikan vaksin IBD aktif galur intermediate dengan dosis vaksinasi 10 2 EID50 (untuk dosis penuh), 50 EID50 (dosis ½) dan 25 EID50 (dosis ¼), kelompok K4 divaksinasi dengan ND tetes tetapi tidak divaksin dengan IBD. Dosis perlakuan pada setiap kelompok ayam dapat dilihat pada Tabel 1.
15 Tabel 1 Perlakuan vaksinasi IBD dan ND pada masing-masing kelompok ayam Perlakuan Kelompok ayam perlakuan K1 (IBD penuh) K2 (IBD ½) K3 (IBD ¼) K4 (IBD 0) Vaksinasi ND dan IBD - Challenge dengan virus IBD (10 ekor) (10 ekor) (10 ekor) (10 ekor) Koleksi darah Timbang BB Koleksi BF Uji Tantang dengan Virus IBD. Isolat virus IBD lapang lokal diperoleh dari Balai Besar Penelitian Veteriner (BBALITVET), Cimanggu, Bogor. Virus IBD diinfeksikan pada ayam umur 28 hari sebanyak 0.2ml/oral/ekor. terpisah. Peubah yang diamati. Ayam yang ditantang ditempatkan dalam kandang Parameter yang digunakan untuk mengamati efek vaksinasi dan uji tantang dengan virus IBD adalah dengan mengambil sampel darah, penimbangan bobot badan, sampling bursa fabricius, limpa. pengamatan gejala klinis dan kematian. Uji serologi dengan uji HI untuk deteksi antibodi terhadap ND dan ELISA untuk deteksi antibodi anti IBD serta konfirmasi keberadaan virus IBD secara molekuler. Peubah yang diamati meliputi : 1. Bobot Badan dan Bursa Fabricius. Penimbangan bobot badan (g) dan bursa (g) dilakukan pada setiap individu kelompok percobaan seminggu sekali. Rasio bobot badan dan bursa dihitung dalam satuan persen. Hasil perhitungan pada setiap kelompok percobaan dibuat grafik. Rumus perhitungan ratio Bursa Fabricius menurut European Pharmacopoeia 5.0 (2005) dengan bobot badan sebagai berikut: Ratio Bursa Fabricius dengan bobot badan = Bursa Fabricius (g) x 100% bobot badan (g)
16 2. Titer antibodi terhadap IBD Pengambilan sampel darah dimulai pada hari ke-0 untuk mengetahui tingkat antibodi asal induk (maternal antibody=ma). Masing-masing kelompok ayam percobaan pada hari ke-7 dan 28 (sebelum diuji tantang) dan pada hari ke-42 (setelah uji tantang, akhir dari penelitian), diambil sepuluh ekor dan diambil darahnya untuk dikoleksi serumnya. Darah yang dikoleksi disimpan dalam lemari pendingin selama semalam supaya sel darah merah dan serum ayam terpisah. Serum ayam disimpan dalam tabung mikro 1.5 ml steril pada suhu -20 O C sampai akan dianalisa selanjutnya. 3. Perubahan patologis Gambaran patologis ayam percobaan diamati pada hari ke 7, 28 dan 42 setelah vaksinasi dan penantangan. Perubahan patologi dicatat dan diskoring. Uji Serologis Uji Haemagglutinasi Inhibisi (HI). Seluruh sumur microplate V bottom 1-12 diisi dengan PBS steril masing-masing 25 l. Serum yang akan diuji dan masukkan kedalam sumur pertama sebanyak 25 l kemudian lakukan pencampuran serum dengan PBS pada sumur pertama dengan cara mengambil dan mengeluarkan cairan tersebut dengan pipet mikro sebanyak lima kali sebanyak 25 l dari sumur pertama kemudian pindahkan ke sumur kedua dan lakukan pencampuran seperti di atas, selanjutnya pindahkan 25 l ke sumur ke- 3, begitu seterusnya sampai sumur ke 12. Larutan pada sumur ke- 12 diambil 25 l dan dibuang. Seluruh sumur selanjutnya ditambahkan suspensi virus standar (4 HAU) masing-masing 25 l Microplate digoyanggoyang kemudian diinkubasikan pada suhu 4 o C selama 60 menit. Selanjutnya ditambahkan 25 l suspensi sel darah merah 1% ke dalam seluruh sumur. Microplate kembali dikocok dengan menggoyang-goyangkannya, kemudian diinkubasikan pada suhu 4 o C selama 60 menit. Selanjutnya dilakukan pembacaan
17 hasil saat kontrol positif sudah membentuk drop eye. Hasil pembacaan uji HI dihitung titernya dan dibuat nilai rata-rata Geometric Titre Mean (GMT). Uji ELISA-IBD. ELISA dilakukan mengikuti prosedur kit ELISA IBD dari Biocheck(Babiker, 2008b). Serum sampel diencerkan dengan perbandingan 1:500 dengan bufer pengencer. Kontrol negatif dimasukkan pada lubang A1 dan A2 pada plate yang sudah ditempeli dengan antigen, kontrol positif pada A3 dan A4. Reference Kontrol berada pada lubang A5. Serum yang telah diencerkan dimasukkan pada lubang A6, A7, A8 dan seterusnya. Plate tersebut diinkubasi pada suhu 22-27 0 C selama 30 menit. Selanjutnya dicuci selama 3-5 kali dan ditambahkan konjugat pada semua lubangnya. Inkubasi juga dilakukan selama 30 menit pada suhu yang sama. Setelah itu plate dicuci 3-5 kali, dan diteruskan dengan penambahan substrat dan diinkubasi selama 15 menit. Pada saat inkubasi tepat 15 menit, ditambahkan stop solution untuk menghentikan reaksi pada plate. Selanjutnya plate dibaca absorbansinya, yang kemudian dikonversikan ke dalam titer. Pembacaan hasil ELISA dilakukan dengan melewatkan plat ELISA pada mesin ELISA pada panjang gelombang 405nm. Hasil absorbansi yang muncul dibandingkan dengan standar yang sudah ditetapkan menurut petunjuk yang ada pada kit tersebut dan dibuat rata-rata nilai Geometric Titre Mean (GMT). Uji Molekuler Pengujian secara molekuler dilakukan untuk mengkonfirmasi virus yang menginfeksi ayam adalah virus IBD. Primer yang digunakan untuk pengujian ini adalah spesifik untuk virus IBD. Isolasi RNA. Total RNA diperoleh dari organ BF menggunakan kit RNEasy Protect Mini Kit, QIAGEN mengikuti prosedur yang disarankan. Sebanyak 30 mg organ Bursa fabricius digerus bersama dengan nitrogen cair menggunakan mortar dan pestle sampai halus. Ke dalam gerusan tersebut selanjutnya ditambahkan
18 500µl bufer lisis kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12.000rpm selama 1 menit. Supernatan yang terbentuk di pindahkan ke tabung mikro baru dan steril secara hati-hati dengan pipet mikro. Ke dalam tabung ditambahkan 500µl bufer RLT dan pipetted supaya homogen. Sebanyak 750 µl campuran ini dimasukkan kedalam kolom QIAGEN dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit, selanjutnya kedalam kolom ditambahkan 750 µl bufer pencuci RW dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000rpm selama 3 menit. Pencucian kolom dilakukan sebanyak dua kali. Ke dalam kolom ditambahkan bufer elusi sebanyak 50µl dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit. Hasil elusi (total RNA) digunakan untuk proses RT-PCR. Reverse transcription-pcr (RT-PCR). Uji RT-PCR dilakukan menggunakan pasangan primer yang mengamplifikasi daerah 672pb vvp2 (Li et al. 2009). Primer forward yang digunakan yaitu 5 -GCCGATGATTACCAATTCTCATC-3 dan primer reverse 5 -CCGGATTATGTCTTTGAAGC-3. Pereaksi RT-PCR menggunakan RT-PCR Access Quick (PROMEGA), sebagai berikut: 5x AMV Tfl PCR Buffer; 10mM dntp mix; 25mM MgSO4; 10pmol Primer F; 10 pmol primer R; 5U/ul Tfl Polymerase. Campuran PCR diinkubasi pada suhu 42 o C selama 45 menit. cdna sebagai cetakan DNA diamplifikasi pada PCR sebanyak 36 siklus pada 95 o C selama 1 menit, 56 o C selama 45 detik dan 72 o C selama 50 detik. Suhu perpanjangan akhir 72 o C selama 10 menit. Hasil RT-PCR dilewatkan pada 2% gel agarose dalam 1x TBE, bufer yang digunakan adalah 1x TBE. Voltage yang digunakan yaitu 100V selama 60 menit. Gel agarose kemudian di rendam dalam larutan ethidium bromide selama 15 menit. Gel agarose diletakkan di atas UV transilluminator untuk melihat pita yang muncul. Hasil elektroforesis kemudian didokumentasikan.