PENENTUAN KADAR INULIN DALAM EKSTRAK BUAH PISANG (Musa paradisiaca, Linn.) SEBAGAI PREBIOTIK DENGAN METODE KLT - DENSITOMETRI Yuni Retnaningtyas 1) Lestyo Wulandari 1) Rahayu Mustika Sari 2) ABSTRACT Banana is one of prebiotic resource food which is duitable nutrition for bactery either bifidobacterium, eubacterium or lactobacillus, but it is not suitable for bad bactery such as clostridium, shigella, and veillonella. The advantages of prebiotic come from Inulin which is a polimer compound comes from fructose units.this research aimed to develop a Thin Layer Chromatography Densitometry method of inulin analysis in Banana. Separation of inulin from the sample was performed using Silica Gel F254 with isocratic elution system using acetonitrile : acetone: acetate acid (5:5:4) as mobile phase and detected by using UV detector at wavelength 366 nm. This method validation showed a good linearity with correlation coefficient (r) of 0.9979 while the coefficient of variation of the regression function (Vx0) was 2%. The limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) of the method were respectively 6,86 ng and 20,59 n,. The mean absolute recovery of inulin from the simulation sample was 99,50 % ± 1,75 and the method precision was less than 1,97%. The proposed method applied to the determination of inulin in the banana showed concentration 2,10% ((w/w). So, the proposed TLC- Densitometry method is rapid, simple, and selective for routine analysis. Key words: inulin, banana, TLC-Densitometric. PENDAHULUAN Pisang merupakan salah satu makanan sumber prebiotik yang mampu membantu kekebalan tubuh dalam masa pertumbuhan, menjadikan anak tahan dalam menghadapi demam, nyeri tenggorokan, dan diare. Prebiotik merupakan nutrisi yang sesuai bagi bakteri baik seperti bifidobacterium, eubacterium, dan lactobacillus, tapi tidak cocok bagi bakteri jahat semisal clostridium, shigella, dan veillonella (Modler, 1990). Manfaat prebiotik tersebut berasal dari inulin yaitu suatu senyawa polimer dari unit-unit fruktosa. Inulin bersifat larut dalam air, tetapi tidak dapat dicerna oleh enzim-enzim dalam sistem pencernaan mamalia sehingga 1) Dosen Fakultas Farmasi Universitas Jember 2) Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Jember
mencapai usus besar tanpa mengalami perubahan struktur. Meskipun demikian, inulin dapat mengalami fermentasi akibat aktivitas mikroflora yang terdapat di dalam usus besar sehingga berimplikasi positif terhadap kesehatan tubuh (Widowati, 2005). Dari penelitian terdahulu telah dilakukan uji aktivitas prebiotik ekstrak inulin, diketahui bahwa endapan isolat berwarna putih, tidak berbau, larut dengan air. Berdasarkan uji kualitatif yang telah dilakukan diduga isolat yang diperoleh adalah inulin atau fruktooligosakarida karena mempunyai sifat-sifat yang mirip. Namun perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan standar inulin dan pengujian lainnya seperti uji kromatografi lapis tipis (Yudi et al, 2007). Penelitian ini bertujuan mengembangkan suatu metode KLTdensitometri untuk menentukan kandungan inulin dalam buah pisang. Penelitian tentang penentuan kadar inulin sebelumnya sudah pernah dilakukan diantaranya oleh Anne Franck et al telah melakukan analisis kimia dan determinasi inulin yaitu menggunakan metode HPLC, Gas Chromatography (GC), dan analisis HPAEC. Untuk metode KLT sendiri telah dilakukan oleh peneliti asal Slovenia yaitu B. Simonowska, tiga tahun kemudian dilakukan penelitian kembali menggunakan metode HPTLC. Metode KLT-Densitometri ini dipilih karena jika dibandingkan dengan metode lain, metode KLT memiliki kelebihan yaitu preparasi sampel lebih cepat dan penanganan sampel dalam jumlah besar lebih mudah dilakukan, selain itu biaya operasional juga relatif lebih kecil (Suryadi et al, 2005). METODE PENELITIAN Bahan dan Alat Bahan yang digunakan: standart inulin, diphenilamin, anilin, asam fosfat 85%, metanol p.a, acetonitril p.a, etanol 95 %, aceton p.a, asam asetat p.a, sampel ekstrak Buah Pisang.
Alat alat yang digunakan adalah timbangan analitik Sartorius, mikropipet, vial, bejana camag, lempeng KLT Silica Gel F 254, scanner Densitometer wincats Camag, perangkat komputer dengan program wincats, pengering, oven, alat- alat gelas yang biasa digunakan di laboratorium kimia. Prosedur Kerja Preparasi Sampel Sampel sebanyak 25mg dilarutkan dalam 25ml etanol 95% dan disentrifus selama 10 menit. Preparasi Larutan Standar Larutan standar dibuat dengan cara melarutkan sejumlah standar inulin hingga diperoleh larutan standar induk dengan konsentrasi 2000ppm. Dari larutan standar induk dibuat larutan standar dengan konsentrasi 50ppm, 100ppm, 200ppm, 300 ppm, 400ppm, 500ppm, 600ppm, 700ppm, 800ppm. Optimasi Kondisi Analisis Optimasi Eluen Dilakukan pemilihan eluen dengan komposisi: Acetonitril : aceton : air (5:5:5), Acetonitril: aceton (4:1), Acetonitril : aceton (1:4), Acetonitril : aceton : natrium hidroksida (5:7:2), Acetonitril: aceton : asam asetat (5:5:4). Optimasi Penampak Noda meliputi: Reagen Penampak Noda Dilakukan pemilihan reagen penampak noda dengan komposisi: Vanilin-sulfuric acid, 5% asam sulfat dalam metanol, DAP (2% diphenilamin, 2% anilin dalam metanol, 15 ml asam phospat 85%). Konsentrasi Penampak Noda Pemilihan konsentrasi penampak noda dilakukan dengan menaikkan konsentrasi penampak noda terpilih sehingga diperoleh konsentrasi penampak noda yang optimum. Suhu dan Lama Pemanasan Dilakukan pemilihan suhu pemanasan dengan memanaskan
lempeng pada suhu antara 95 C - 120 C dan dilanjutkan dengan menghitung lama pemanasan yang diperlukan untuk membentuk noda yang berwarna dan dinyatakan dalam satuan menit. Optimasi panjang gelombang Optimasi panjang gelombang dilakukan dengan scanning noda analit pada Camag TLC Scanner 3 (Densito scanner) dan program wincats. Penilaian panjang gelombang optimum dengan melihat spektrum analit yang terbaca pada panjang gelombang maksimal dimana tidak ada spektrum komponen pengotor yang mengganggu. Bila ada Komponen pengotor maka dihitung nilai Rs dengan persyaratan 1,5. HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini telah dilakukan penetapan kadar inulin dalam sampel buah pisang. Kadar inulin dalam penelitian ini ditetapkan dengan menggunakan metode KLT- Densitometri yang sudah dioptimasi dan divalidasi. Kondisi Analisis Yang Optimum Berdasarkan hasil optimasi dapat diketahui bahwa pelarut yang digunakan adalah etanol 95%. Fase gerak yang menghasilkan kromatogram efisien adalah acetonitril : aceton : asam asetat (5:5:4), karena memenuhi syarat parameter efisiensi kromatogram yaitu memiliki nilai theoretical platei (N) yang besar, nilai H (Height Equivalent to a Theoritical Plate) yang paling kecil, nilai Resolusi (Rs) 1,5 dan nilai Rf masuk dalam rentang 0,30 sampai dengan 0,70. Fase diam Lempeng KLT Silika Gel F 254. Scanning panjang gelombang dilakukan pada panjang gelombang (λ) 366 nm. Sebagai penampak noda digunakan DAP dengan konsentrasi 2% diphenilamin, 2% anilin dalam metanol, 15 ml asam phospat 85%. Pemanasan lempeng dilakukan pada suhu 100 O C selama 10 menit.
Gambar 1. Spektra standard Inulin pada panjang gelombang 200 700 nm Gambar 2. Kromatogram standart Inulin dengan eluen yang optimum Validasi Metode Analisis Validasi metode yang dilakukan meliputi Selektivitas / Spesifisitas, Linearitas, Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ), Keseksamaan (precision), dan Kecermatan (accuracy). Selektivitas / Spesifisitas Selektivitas merupakan kemampuan suatu metode yang dapat mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas
ditentukan melalui nilai resolusi. Penilaian nilai resolusi dapat dilihat berdasarkan profil kromatogram pada gambar 3 berikut. = kromatogram standart inulin = kromatogram sampel Gambar 3. Profil kromatogram standart Inulin dan sampel buah Pisang pada λ = 366 nm Berdasarkan gambar 3 dapat diketahui bahwa sampel memiliki matriks pengganggu, sehingga perhitungan parameter selektivitas dari nilai resolusi diperlukan. Dari hasil perhitungan didapat nilai Rs = 11,55 untuk puncak 1 dan Rs = 6,9 untuk puncak 2. Maka dapat dikatakan pemisahan analit inulin dengan matriks pengganggu sempurna karena nilai Resolusi 1,5. Spesifisitas adalah kemampuan suatu metode yang hanya dapat mengukur zat tertentu saja (analit). Kespesifikan dapat dilihat melalui uji kemurnian (purity) dan uji identitas (identity) yang dapat dilihat pada gambar 4 berikut.
= spektra standard Inulin = spektra sampel Gambar 4. spektra sampel dan standart pada uji purity Berdasarkan gambar 4 dapat dilihat bahwa spektra standart dan sampel pada panjang gelombang (200 nm - 700 nm) memiliki spekta yang hampir sama. Hal ini berarti bahwa di dalam sampel terdapat senyawa Inulin. Perhitungan korelasi spektra pada uji kemurnian dan identitas dapat dilihat pada tabel 1. Tabel 1. Hasil scanning spektrum dari densitometri Track Rf Senyawa r(s,m) r(m,e) Kesimpulan Identitas 1 2 0,72 0,71 Inulin Inulin 0,997232 0,998032 0,999941 0,995999 ok ok Inulin Inulin Pencocokan spektra sampel dan standart Inulin dapat dilihat pada tabel 1, diketahui bahwa perhitungan korelasi spektra dari data densitometri lebih dari 0,990; selain itu dari data yang diperoleh menunjukkan bahwa di dalam sampel terdapat inulin.
Linieritas Pada penelitian linieritas digunakan konsentrasi standart 100,4 ng; 204 ng; 408 ng; 612 ng; 816 ng; 1626 ng. Standart dieluasi, dicelupkan dalam reagen penampak noda, dipanaskan kemudian discanning dan dihasilkan data area standar seperti yang ditunjukkan pada tabel 2. Tabel 2. Koefisien korelasi konsentrasi dan area standart inulin pada uji linieritas Konsentrasi Konsentrasi Area (ng) (log) 100,4 204,0 408,0 612,0 816,0 1626,00 2,001734 2,309630 2,610660 2,786751 2,911690 3,211121 807,39 1488,440 2084,240 2492,040 2644,510 3256,420 Hubungan liniritas antara konsentrasi dalam bentuk logaritma dengan area menghasilkan persamaan regresi y = 2016,9x 3193 dengan R = 0,9979 dan hasil ini memenuhi persyaratan linieritas dimana nilai r = +1 atau 1 (Harmita, 2004). Sensitivitas Penentuan sensitivitas metode dilakukan dengan menetapkan nilai batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ). Dibuat konsentrasi analit standar kafein 10,4ng 204 ng masingmasing konsentrasi ditotolkan 2 µl pada lempeng Silika Gel F 254 menggunakan kondisi terpilih lalu di scanning menggunakan Densitometri dan ditentukan persamaan regresinya dan koefisien korelasinya yang ditunjukkan pada tabel 3. Berdasarkan persamaan regresi ini kemudian ditentukan nilai LOD dan LOQ sehingga diperoleh nilai batas deteksi (LOD) sebesar 6,86527400 ng dan batas kuantitasi (LOQ) adalah 20,59582000 ng..
Tabel 3. Koefisien korelasi konsentrasi dan area standar inulin pada percobaan LOD dan LOQ Koefisien korelasi Persamaan Regresi 0,9999 y = 6,08683000x + 290,6929 Presisi Presisi merupakan derajat kesesuaian diantara masing-masing hasil uji dan ditentukan dengan menghitung nilai relatif standart deviasi (RSD). Kepresisian dilakukan lima kali replikasi dengan pengukuran selama tiga hari yang berbeda, dan didapatkan hasil seperti pada tabel 4. Tabel 4. Data presisi tiga hari percobaan dengan n=5 Hari RSD (n=5) % b/b 1 2 3 2,16% 2,23% 1,52% 1,98 2,07 2,25 Rata-rata 1,97% 2,10% Berdasarkan tabel 4 dapat diketahui bahwa nilai koevisien variasi-nya adalah 2,10%. Disimpulkan bahwa metode ini telah memenuhi syarat kepresisian dengan nilai relatif standart deviasi 2,7% untuk kadar analit 1% - 10% (Huber L., 2007). Akurasi Akurasi merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya, yang ditentukan dengan menghitung nilai persen recovery (perolehan kembali). Perhitungan keakuratan pada penelitian ini digunakan metode penambahan baku. Pengukuran dilakukan dengan 3 kali replikasi sehingga didapatkan data seperti tabel 5.
Tabel 5. Hasil rata- rata akurasi Kadar rata-rata (%) b/b Penambahan % Recovery 2,10% 30 % 45 % 60 % 99,04 101,43 98,04 Rata - rata 99,50 % ± 1,75 Berdasarkan Tabel 5 diketahui % Perolehan kembali (%recovery) pada berbagai penambahan adalah 99,50 % ± 1,75. Dimana nilai ini berada pada rentang yang diperbolehkan yaitu 97 sampai 103 % (Huber L., 2007), sehingga metode ini memenuhi syarat keakuratan. Penentuan Kadar Inulin Dalam Sampel Ekstrak Buah Pisang Penentuan kadar inulin dalam sampel ekstrak Buah Pisang dilakukan dengan preparasi standart, preparasi sampel, dieluasi, dicelupkan dalam reagen penampak noda, dipanaskan dan dilakukan scanning dengan densitometer. diketahui kadar inulin dalam buah Pisang adalah sebesar 2,10 % KESIMPULAN Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa : 1. Preparasi sampel yang optimum dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol 95%, volume pelarut sebanyak 25 ml, lama ultrasonik selama 10 menit. 2. Kondisi optimum metode KLT- Densitometri untuk analisis inulin dalam Buah Pisang yaitu diamati pada panjang gelombang 366 nm, menggunakan pelarut etanol 95%, eluen acetonitrile: acetone: asam asetat (5:5:4), dan menggunakan fase diam lempeng KLT silica gel F 254. 3. Metode KLT-Densitometri untuk inulin memberikan hasil yang spesifik karena tidak ada pengganggu, linier karena memiliki koefisien korelasi = 0,9979, seksama karena RSD-nya
= 1,97% peka karena memiliki 6,86527400 ng dan batas kuantitasi adalah 20,59582000 ng, serta akurat karena menghasilkan % recovery 99,50 % ± 1,75. 4. Kadar inulin dalam ekstrak buah Pisang sebesar 2,10%. SARAN Berdasarkan penelitian dapat disarankan bahwa : 1. Perlu dilakukan penelitian analisis inulin pada sampel lain yang mengandung inulin seperti dalam bawang merah, bawang putih, asparagus, gandum, dan barley karena kadar inulin dalam buah pisang relatif kecil. DAFTAR PUSTAKA Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian.Vol. I, no.3, 117 135. Desember 2004. Jakarta: Universitas Indonesia Press. Huber, L. 2007. Validation and Qualification Analytical Laboratories 2 nd. Informa Healthcare New York USA. Indrayanto, A., Indrayanto G., & Muhammad, M. 2003, Validation Method of Analysis v1.03. Software from General Public Licence. Faculty of Pharmacy. Surabaya : Airlangga University. Low H. N., McLaughlin A.M., Page W. S., Canas J. B., Brause R.A., Low H. N., (2001)Identification of Hydrolyzed Inulin Syrup and High-Fructose Corn Syrup in Apple Juice by Capillary Gas Chromatography PVM 4:1999, Journal of AOAC International, p.486-492 Meyer, D. & B. Tungland. 2001. Inulin A Pure Soluble Dietary Fibre. [serial on line]. http://www.nutraceuticalsnow. com/issues/back/2001winter/in ulin.php. [17 Maret 2007] Modler, H.W.; R.C. McKellar & M. Yaguchi. 1990. Bifidobacteria and Bifidogenic Factors- Review. di dalam Tungland, B.C. 2000. Inulin A Comprehensive Scientific Review. Duncan Crow Wholistic Consultan. [serial on line]. http://members.shaw.ca/duncan crow/inulin_review.html. [17 Maret 2007]
Prosek, M., Simonovska, B., Golcwondra,T., Vovk, I., Andrensek, S., Micovic, E., Golob, T., (2007), Use of HPTLC for Quantitative Evaluation of Inulin in Food Product, Journal of Planar Chromatography- Modern TLC, 0933-4173, 58-62 Satiadarma, Mulja, Thahjono & Kartasasmita. 2004. Asas Pengembangan Prosedur Analisis. Edisi Pertama. Surabaya: Airlangga University Press. Sherma, J & Fried, B. 2004. Hand Book of Thin Layer Chromatography. 3 rd edition, revised and expanded. New York: Marcel Dekker, Inc. Simonovska, B.(2000), Determination of Inulin in Food, Journal of AOAC International, 83,675-678 Stahl, E. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Bandung: Penerbit ITB. Suryadi, H., Kurniadi M., &Yohanes A. 2005. Analisis Kuantitatif Aflatoksin dalam Bumbu Pecel secara KLT Densitometri. Departemen Farmasi FMIPA, Universitas Indonesia. Kampus UI, Depok. [serial on line]. http.//www.ns.ui.ac.id/seminar 2005/Data/SPF-03.pdf. [13 Juni 2007] TLC Scanner 3 with WinCATS Software. 2007. www.camag.com Touchstone, J.C. & Dobbins, M. F. 1983. Practice of Thin Layer Chromathography. 2 nd ed., John Willey and Sons. Universitas Jember. 2006. Pedoman Penulisan Karya Ilmiah. Jember: Badan Penerbit Universitas Jember. Wicaksono, Yudi., Suryanto, Yuni Retnaningtyas & Lestyo W. 2007. Pemanfaatan Ekstrak Inulin Buah Pisang (Musa paradisiaca, Linn.) Sebagai Tablet Kunyah Prebiotik. Universitas Jember. Widowati, S. 2005. Ekstraksi, Karakterisasi, dan Kajian Potensi Prebiotik Inulin Umbi Dahlia (Dahlia pinnata L.). Seminar Rutin Puslitbang Tanaman Pangan, Bogor. [serial on line] [16 Juni 2005] Zuleta A., Simbucetti, M. E. (2001), Inulin Determination for Food Labeling, Agric. Food Chem, 49(10), 4570-4572