BAB III METODELOGI PENELITIAN 3.1 JENIS PENELITIAN : Eksperimental Laboratoris 3.2 LOKASI PENELITIAN : Laboratorium Fatokimia Fakultas Farmasi UH & Laboratorium Mikrobiologi FK UH 3.3 WAKTU PENELITIAN : Maret April 3.4 DEFENISI OPERASIONAL : a. Bakteri Streptococcus mutans merupakan isolat yang telah tersedia diperoleh dari Labolatorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran UH. b. Ekstrak Buah Kaktus Pir Berduri (Opuntia ficus-indica) adalah buah yang dipetik dari tanaman mengkudu yang tumbuh di daerah Jawa Timur c. Daya Hambat diketahui dari uji kadar hambat antimikroba sari buah kaktus pir berduri ( Opuntia ficus-indica) berupa konsentrasi dari sari buah kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica) yang dapat menghambat pertumbuhan Streptococcus mutans secara nyata pada medium kultur setelah inkubasi. d. Zona Inhibisi adalah luas daerah bening pada biakan medium bakteri setelah diinkubasi yang diukur diameternya dengan menggunakan jangka sorong (mm). 25
e. Konsentrasi sampel adalah konsentrasi dari sari buah kaktus pir berduri yang dibuat dengan memotong motong buah tersebut dengan menggunakan pisau dan dicampurkan dengan aquades kemudian disaring dan diambil sarinya. Konsentrasi dibuat dalam 4 jenis yaitu 25%, 50%, 75%, 100%. f. Medium adalah Natrium Agar (NA) yang dibuat dari sediaan yang disediakan dari labolatorium ini digunakan sebagai media untuk melihat daya hambat bakteri. 3.5 POPULASI dan SAMPEL Sampel dalam penelitian ini adalah biakan murni Streptococcus mutans dan ekstrak buah kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica) dalam 4 kali pengenceran, masing masing 25%, 50%, 75%, 100%. Pada setiap kelompok konsentrasi dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. 3.6 KRITERIA PENILAIAN: a. Pada uji Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) dilakukan denga n menggunakan metode dilusi. Tabung dengan berbagai konsentrasi diamati kekeruhannya, pada tabung dengan konsentrasi terendah yang pertama kali terlihat jernih merupakan Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) b. Pada uji efek antibakteri, menggunakan metode difusi, yang diukur adalah zona inhibisi/diameter Daya Hambat (DDH). Luas zona 26
inhibisi merupakan diameter daerah yang bening yang diukur dengan menggunakan jangka sorong dalam satuan mm (millimeter). 3.7 ALAT DAN BAHAN PENELITIAN A. ALAT: 1. Autoklaf 10. Jangka sorong 2. Batang pengaduk 11. Labu erlenmeyer 3. Botol fial 12. Ose bulat 4. Bunsen 13. Pinset 5. Cawan petri 14. Pisau 6. Cawan porselen 15. Rotavavor 7. Corong 16. Tabung reaksi 8. Gelas Ukur 17. Toples 9. Inkubator B. BAHAN: 1. Aluminium foil 2. Aquades 3. Ekstrak buah kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica) 4. Handscoen 5. Isolat murni Streptococcus mutans dari laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran UH 6. Kapas 27
7. Kertas label 8. Masker 9. Spritus 3.8 PROSEDUR KERJA a. Pembuatan Ekstrak buah kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica) 1. Untuk pembuatan ekstrak kaktus pir berduri (Opuntia ficus-indica) disiapkan buah kaktus sebanyak 3 kg yang sudah dicuci bersih. 2. Setelah itu, buah kaktus pir berduri ( Opuntia ficus-indica) dipotong menjadi potongan potongan yang kecil. 3. Selanjutnya, buah kaktus pir berduri ( Opuntia ficus-indica) di ekstrak menggunakan cara maserasi, yaitu dengan merendam buah kaktus pir berduri ke dalam bejana maserasi yang terbuat dari toples kaca kemudian diberi larutan etanol 96%. 4. Bejana maserasi tersebut ditutup rapat dan didiamkan selama 3 hari sambil diaduk satu kali setiap hari. 5. Setelah 3 hari, rendaman kaktus disaring dan ampasnya direndam dengan cairan penyaring yang baru. 6. Hasil penyaringan yang diperoleh dikumpul dan diuapkan dengan menggunakan rotavavor. Proses ini bertujuan untuk menguapkan etanol sehingga diperoleh ekstrak buah kaktus pir berduri yang padat dan kering. 28
b. Strerilisasi alat Sterilisasi alat yang digunakan dalam penelitian ini dilakukan dengan cara sebagai berikut: 1. Labu erlenmeyer diisi dengan aquades sebanyak 250 ml lalu ditutup dengan kapas yang dipadatkan sedemikian rupa dan ditutup dengan aluminium foil dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 25 menit. 2. Cawan petri, pinset, batang pengaduk, dan tabung reaksi dibungkus dengan aluminium foil dan disterilkan dengan oven. 3. Bahan yang disterilkan adalah medium pembenihan. Cara sterilisasi adalah medium NA yang telah dimasukkan ke dalam erlenmeyer kemudian disterilkan ke dalam autoklaf selama 25 menit pada suhu 121 o C c. Penentuan Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) ekstrak buah kaktus pir berduri ( Opuntia ficus-indica) yang dapat menghambat pertumbuhan Streptococcus mutans 1. Ekstrak buah kaktus pir berduri diencerkan dengan rumus: m = M x V m : massa buah kaktus pir berduri (gram) M: Konsentrasi larutan (gr/ml) V: Volume Larutan (ml) 29
2. Untuk memperoleh ekstrak buah kaktus pir berduri konsentrasi 25%, 50%, 75%, 100%. Maka ekstrak buah kaktus pir berduri ditimbang sebanyak 5 gram, 7,5 gram, 10 gram kemudian dilarutkan dengan aquades sebanyak 10 ml. 3. Setelah itu dimasukkan kedalam tabung dan diberi label sesuai konsentrasinya. 4. Dilakukan pengenceran suspensi bakteri. 5. Sebanyak delapan buah tabung disiapkan dan diisi dengan medium BHIB sebanyak 5 ml. Kemudian 0,02 ml bakteri Streptococcus mutans dimasukkan pada 6 tabung. 6. Pada lima tabung, masing masing dimasukkan ekstrak buah kaktus pir berduri 25%, 50%, 75%, 100%, sebanyak 5 ml. Satu tabung dimasukkan 5 ml ekstrak daun sirih 100%, serta tabung berikutnya dimasukkan 5 ml aquades dan pada tabung terakhir hanya berisi medium BHIB dan bakteri yang digunakan sebagai kontrol kuman (kontrol bakteri). 7. Semua tabung diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam dan kemudian dilakukan pemeriksaan ada tidaknya pertumbuhan bakteri yang ditandai dengan terjadinya kekeruhan dalam tabung. 8. Konsentrasi Hambat Minimal ditentukan dengan memperhatikan konsentrasi pertama yang terlihat jernih. Tabung yang terlihat keruh menunjukkan masih adanya pertumbuhan bakteri. 30
d. Pembuatan Medium 1. Komposisi NA (Nutrirnt Agar) - Beef extract 3 gr - Pepton 5 gr - Agar 15 gr - Aquadest 1000 ml 2. Cara membuat Medium NA dilarutkan sebanyak 38g ke dalam 1 liter aquadest. Kemudian sterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 C selama 25 menit. Biarkan hingga suhunya turun sampai 40 C kemudian tuangkan ke dalam tabung reaksi. e. Pengenceran Pengenceran bertujuan menghasilkan beberapa konsentrasi ekstrak buah kaktus ( Opuntia ficus-indica) yang akan digunakan untuk Kadar Hambat Minimum dari ekstrak buah kaktus yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Dalam penelitian ini dibuat pengenceran sebanyak 4 konsentrasi yaitu : 25%, 50%, 75%, dan 100%. f. Uji daya hambat 1. Persiapkan 6 buah cawan petri steril 2. Ketiga cawan petri tersebut diisi dengan medium NA yang telah disterilkan. Tunggu medium hingga memadat 31
3. Ambil isolate murni yang telah dipersiapkan dengan menggunakan ose bulat. Kemudian dimasukkan kedalam tabung yang berisi aquadest steril. 4. Isolat yang telah bercampur dengan aquadest tersebut kemudian di goreskan ke medium NA dengan menggunakan cotton buds 5. Lakukan hal yang sama pada cawan petri kedua sampai keenam 6. Ambil beberapa paper disk dan kemudian direndam pada tabung yang berisi konsentrasi ekstrak buah yang berbeda 7. Untuk cawan petri pertama sampai cawan petri ketiga masing masing diberikan paper disk yang telah direndam dengan ekstrak buah kaktus pada konsentrasi 2,5% sampai 100% 8. Masukkan kedalam inkubator selama 1x24 jam g. Pengamatan zona inhibisi Daya hambat diketahui berdasarkan pengukuran diameter zona inhibisi (zona bening) yang terbentuk disekitas paper disc. Pengukuran tersebut menggunakan jangka sorong. Daya hambat minimal diketahui dari konsentrasi terkecil yang sudah dapat menghambat pertumbuhan streptoccus mutans secara nyata. 32
3.9 ALUR PENELITIAN Pembuatan bahan uji Pengenceran bahan uji Konsentrasi Ekstrak Buah Kaktus Pir berduri 25% 50% 75% 100% Pembuatan Medium Kultur Pemurnian Streptoccus mutans Uji Daya Hambat Inkubasi Pengamatan zona inhibisi Analisis Data Gambar 4: Skema alur penelitian 33