KAJIAN PENANDA GENETIK GEN CYTOCHROME B DAN DAERAH D-LOOP PADA Tarsius sp. OLEH : RINI WIDAYANTI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006 i
ABSTRACT RINI WIDAYANTI. The Study of Genetic Marker on Cytochrome B gene and D- loop region of Tarsius sp.. Under the direction of DEDY DURYADI SOLIHIN, DONDIN SAJUTHI and R. R. DYAH PERWITASARI. Tarsius is an endemic species of Indonesia that is threatened. Conservation of this species would yield better results if its genetic make up and diversity determined. The objective of this research was to study the specific genetic marker on Cyt b gene and D-loop region of Tarsius sp. Sequencing of PCR product using primer H15149 on Cyt b gene yielded base sequence of 276 nts (coding 92 amino acids), while sequencing using primer DLTARPROF on D-loop resulted in base sequence of 270 nts. Results of Cyt b and D-loop fragments sequencing were put on multiple alignment with other primates from Genbank with the aid of software Genetyc-Win Version 3.0 and Clustal W, and were analyzed using MEGA program version 3.1.Fourteen different amino acid sites were found. Tarsius dianae had 12 amino acid sites (amino acid no. 2, 6, 9, 22, 23, 29, 39, 41, 42, 45, 55, and 85), T. spectrum had 7 amino acid sites (amino acid no. 2, 6, 9, 41, 45, 55 and 85) and T. bancanus had 2 amino acid sites (amino acid no. 23 and 45) which can be used as genetic marker. Five unique amino acids were found on T. dianae, such as amino acid site: 6 (valine), 22 (alanin), 29 (alanin), 39 (serin) and site 42 (valine). The genetic distance based on nucleotide Cyt b calculated using Kimura 2-parameter model indicated that in the smallest value of 0.7%, biggest 22.3% and average 13.1%, while for D-loop, the smallest genetic distance is 0% and biggest 11.8% and average 2.3%. The phylogenetic tree using neighbor Joining Method based on the sequence of nucleotide and amino acid Cyt b reveded differentiation among Tarsius, but the phylogenetic tree based on some nucleotide sequence on D-loop region could not be used to differentiate among species. ii
ABSTRAK RINI WIDAYANTI. Kajian Penanda Genetik Pada Gen Cytochrome B dan Daerah D-loop Tarsius sp.. Dibimbing oleh DEDY DURYADI SOLIHIN, DONDIN SAJUTHI, R.R. DYAH PERWITASARI Tarsius merupakan salah satu satwa endemik Indonesia yang keberadaannya mulai memprihatinkan. Konservasi sebagai salah satu cara untuk pelestarian satwa ini akan lebih terarah dan berhasil guna apabila karakteristik dan keragaman sumber genetiknya diketahui dengan pasti. Tujuan dari penelitian ini adalah mengkaji penanda genetik spesifik pada gen Cyt b dan daerah D-loop Tarsius sp. Penentuan runutan hasil PCR menggunakan primer H15149 pada gen Cyt b didapatkan runutan basa sebesar 276 nt (menyandi 92 asam amino), sedangkan hasil pengurutan menggunakan primer DLTARPROF pada daerah D- loop didapatkan runutan basa sebesar 270 nt. Fragmen Cyt b dan D-loop hasil pengurutan disejajarkan berganda dengan primata lain dari data Genbank dengan bantuan perangkat lunak Genetyx-Win versi 3.0 dan Clustal W, kemudian dianalisis dengan menggunakan program MEGA versi 3.1. Dari hasil analisis diperoleh 14 situs asam amino yang berbeda. Tarsius dianae memiliki 12 situs asam amino (asam amino ke 2, 6, 9, 22, 23, 29, 39, 41, 42, 45, 55, 85), T. spectrum memiliki 7 situs asam amino (asam amino ke 2, 6, 9, 41, 45, 55 dan 85) dan T. bancanus memiliki 2 situs asam amino (ke 23 dan 45) yang dapat digunakan sebagai penanda genetik. Lima asam amino unik ditemukan pada T. dianae, yaitu pada situs asam amino ke 6 (valina), ke 22 (alanina), ke 29 (alanina), ke 39 (serina) dan ke 42 (valina). Jarak genetik berdasar nukleotida Cyt b yang dihitung menggunakan model 2 parameter Kimura ditemukan nilai paling kecil sebesar 0,7%, nilai paling besar 22,3% dan rata-rata 13,1%, sedangkan pada D-loop jarak genetik paling kecil adalah 0% dan nilai paling besar 11,8% dengan rata-rata 2,3%. Filogram menggunakan metode neighbor joining berdasar hasil penentuan runutan nukleotida dan asam amino Cyt b tersebut dapat dijadikan pembeda masingmasing spesies Tarsius, tetapi filogram berdasar runutan nukleotida pada daerah D-loop tidak dapat digunakan untuk membedakan spesies Tarsius tersebut. Kata kunci: Tarsius sp., D-loop, Gen Cyt b, asam amino, runutan DNA iii
KAJIAN PENANDA GENETIK GEN CYTOCHROME B DAN DAERAH D-LOOP PADA Tarsius sp. OLEH : RINI WIDAYANTI Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Primatologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006 iv
Judul Disertasi Nama NRP Program Studi : Kajian Penanda Genetik Gen Cytochrome B dan Daerah D-loop pada Tarsius sp. : Rini Widayanti : P30600001 : Primatologi Menyetujui, 1. Komisi Pembimbing Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST, Ph.D Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, MSc Mengetahui, 2. Ketua Program Studi Primatologi 3. Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Sri Supraptini Mansjoer Prof. Dr.Ir. Syafrida Manuwoto, MSc Tanggal ujian: 26 Januari 2006 Tanggal lulus: v
SURAT PERNYATAAN Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa segala pernyataan dalam disertasi saya yang berjudul: KAJIAN PENANDA GENETIK GEN CYTOCHROME B DAN DAERAH D-LOOP PADA Tarsius sp. Merupakan gagasan atau hasil penelitian disertasi saya sendiri dengan bimbingan Komisi Pembimbing, kecuali yang dengan jelas ditunjukkan rujukannya. Disertasi ini belum pernah diajukan untuk memperoleh gelar pada program sejenis di perguruan tinggi lain. Semua data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya. Bogor, 26 Januari 2006 Rini Widayanti Nrp. P30600001 vi
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Magelang pada tanggal 25 Januari 1963 dari ayah Djuwari (alm) dan ibu Hidajati. Penulis merupakan anak ketiga dari lima bersaudara. Pendidikan Sekolah Dasar diselesaikan pada tahun 1974 di SD Cacaban III Magelang, Sekolah Menengah Pertama lulus tahun 1977 di SMP Negeri I Magelang dan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri I Magelang lulus pada tahun 1981. Sarjana Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta diselesaikan pada tahun 1986, selanjutnya profesi Dokter Hewan diperoleh pada tahun 1987. Pada tahun 1999 penulis menyelesaikan S2 untuk program studi Sain Veteriner di Sekolah Pascasarjana Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Penulis pada tahun 2000 mendapat kesempatan untuk mengikuti program S3 pada program studi Primatologi di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Beasiswa pendidikan Pascasarjana diperoleh dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Republik Indonesia. Penulis bekerja sebagai dosen untuk mata kuliah Biokimia di Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta sejak tahun 1989 sampai sekarang. vii
PRAKATA Puji syukur ke hadirat Allah SWT penulis panjatkan atas segala karunia- Nya sehingga berhasil menyelesaikan disertasi yang berjudul Kajian Penanda Genetik Gen Cytochrome B dan Daerah D-loop Pada Tarsius sp.. Disertasi ini diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar doktor pada Sekolah Pascasarjana di Institut Pertanian Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir Dedy Duryadi Solihin, DEA, selaku ketua komisi pembimbing serta Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST, Ph.D dan Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari. M.Sc. selaku anggota komisi pembimbing atas waktu, bimbingan, perhatian dan nasehat yang telah diberikan kepada penulis sejak awal rencana penelitian hingga selesainya penulisan disertasi ini. Terima kasih penulis sampaikan juga kepada Dr. Ir. Achmad Farajallah M.Si selaku penguji luar komisi pada sidang tertutup dan kepada Prof. Dr. Ir. H. Abdullah Syam, M.Sc dan Ir. Muladno, M.Sc., Ph.D selaku penguji luar komisi pada sidang terbuka atas masukan dan koreksinya, sehingga lebih sempurnanya disertasi ini. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Sri Supraptini Mansjoer selaku Ketua Program Studi Primatologi dan staf pengajar Program Studi Primatologi, Dr. drh. Joko Pamungkas, M.Sc selaku Kepala Pusat Studi Satwa Primata, LPPM-IPB dan Dr. Ir Komang G Wiryawan selaku Kepala Pusat Studi Ilmu Hayati, PAU-IPB yang telah memberi ijin penulis melakukan penelitian beserta fasilitasnya di laboratorium Biologi Molekuler, PSIH-PAU, IPB. Dalam kesempatan ini pula, penulis mengucapkan terima kasih kepada bapak Drs. Yulius Duma, MSi, Dr. Saroyo dan Dr. Hengki Johannis Kiroh yang telah membantu dalam memperoleh sampel Tarsius. Penulis berterima kasih pula kepada rekan-rekan PRM, teman seperjuangan di lab (mbak Niken, dik Evi, Ari, dan Chule, bu Amin, bu Donata, pak Is, pak Asep, pak Jack, pak Sinaga, pak Heri) atas dukungan dan kerjasamanya. Untuk mas Prapto, Galih, Wida dan Tika, ibu dan saudaraku terima kasih atas dukungan dan doanya. Akhirnya, ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada lembaga yang memberikan bantuan selama penulis menjalani program doktor, yaitu DIKTI melalui BPPS dan Universitas Gadjah Mada. viii
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR.. DAFTAR TABEL..... DAFTAR LAMPIRAN..... PENDAHULUAN.... Latar Belakang Ruang Lingkup Penelitian. Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian. Hipotesis.. TINJAUAN PUSTAKA... Tarsius sp.. Klasifikasi... Morfologi Karakteristik dan Anatomi T. spectrum dan T. dianae... Ekologi Penyebaran Usaha Konservasi..... DNA Mitokondria (mt-dna).. Cytochrome b.. D-loop.... BAHAN DAN METODE.. Tempat dan Waktu Penelitian.. Rancangan Penelitian Koleksi Contoh Darah dan Otot... Isolasi DNA Total Amplifikasi DNA dengan PCR.. Penentuan Runutan Nukleotida... Analisis Data... HASIL DAN PEMBAHASAN... DNA Total.... Amplifikasi Gen Cyt b dan D-loop... Amplifikasi Gen Cyt b........ Amplifikasi daerah D-loop... xi xiii xv 1 1 2 3 3 3 4 4 4 6 8 9 9 11 12 15 17 20 20 20 20 21 22 23 24 26 26 26 26 27 ix
Penentuan Runutan Nukleotida Gen Cyt b Parsial..... Keragaman Runutan Asam Amino... Keragaman Runutan Nukleotida Hubungan Kekerabatan Tarsius sp. Berdasar Runutan Nukleotida dan Asam Amino Cyt b Parsial. Penentuan Runutan Nukleotida D-loop Parsial Keragaman Runutan Nukleotida... Hubungan Kekerabatan Tarsius sp. Berdasar Runutan Nukleotida D-loop Parsial. Keragaman Runutan Nukleotida Gen Cyt b dan D-loop.. Hipotesis Terjadinya Keragaman Tarsius sp. di Sulawesi. Konsistensi Hubungan Kekerabatan Tarsius sp.... Strategi Konservasi untuk Tarsius sp. SIMPULAN DAN SARAN..... Simpulan.. Saran DAFTAR PUSTAKA... 29 29 35 40 42 42 44 45 46 49 53 58 58 58 59 x