32 BAB III METODE DAN PROSEDUR A. Jenis Penelitian Penelitian yang dilaksanakan merupakan penelitian eksperimen, karena adanya perlakuan yang diberikan pada objek yang diteliti serta adanya kontrol penelitian yang berperan sebagai pembanding. 61 B. Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan mulai bulan Maret sampai dengan Mei 2013, di Laboratorium Mikrobiologi Tadris Biologi, Jurusan Tarbiyah STAIN Palangka Raya. C. Populasi dan Sampel Penelitian Populasi pada penelitian ini adalah semua Pityrosporum ovale yang menyebabkan penyakit Pitiriasis sika pada kulit kepala manusia, sedangkan sampel penelitian adalah sebagian dari Pityrosporum ovale yang kemudian ditumbuhkan pada 24 medium lempeng SDA (Sabouraud Dextrose Agar). Kultur murni Pityrosporum ovale yang digunakan sebagai sampel penelitian diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Universitas Brawijaya Malang. 61 Dr. Ir. Kemas Ali Hanafiah, M.S, Rancangan Percobaan (Teori dan Aplikasi),: Jakarta: Rajawali Pers, 2010, h. 2 32
33 D. Instrumen Penelitian Instrumen penelitian yang digunakan dalam penelitian adalah sebagai berikut: 1. Alat-alat yang digunakan Alat-alat yang digunakan meliputi mikroskop cahaya Olympus, kaca penutup, autoklaf, hand sprayer 200 ml, cawan petri, lup, labu erlenmenyer (150ml), jarum inokulasi, kaca benda, beaker glass (50 ml, 200 ml, 500 ml), jangka sorong, penggaris (30 cm), kertas grafik, gelas ukur (10 ml, 25 ml, 100 ml), rak tabung reaksi, timbangan, Laminar Air Flow (LAF), tabung reaksi phyrex 10 cm, syrink, saputangan, lampu spritus, blender, kertas saring, corong kaca, korek api, pisau, panci, kompor gas, neraca digital, dan mikropipet 0,5 10 μl. 2. Bahan-bahan yang digunakan Bahan-bahan yang digunanakan meliputi daun ketepeng cina (Cassia alata L. ) yang diperoleh dari Jalan Berlian III Palangka Raya, SDA bubuk, maltosa dan pepton dari Laboratorium kimia PT. Panadia Corporation Indonesia, etanol 70% dan etanol 90% Dian Laboratoria Indonesia, akuades, kapas, kultur murni Pityrosporum ovale pada medium SDA. E. Metode Penelitian 1. Variabel Penelitian Variabel bebas dalam penelitian ini adalah perlakuan konsentrasi ekstrak daun ketepeng cina, sedangkan variabel terikatnya adalah pertumbuhan Pityrosporum ovale pada medium lempeng SDA.
34 Sebagai parameter pertumbuhan koloni Pityrosporum ovale adalah ukuran jarak koloninya yang tumbuh paling dekat dengan paper disc yang mengandung ekstrak daun ketepeng cina. F. Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL), karena faktor kondisi lingkungan dapat diseragamkan (homogen), kecuali faktor perlakuan yang diberikan. Berlandaskan penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya, yaitu penelitian yang dilakukan oleh Hujjatusnaini (2000) dengan judul Pengaruh Ekstrak Daun Ketepeng Cina (Cassia alata L.) Terhadap Penghambatan Pertumbuhan Trichophyton sp, maka rentangan dan taraf konsentrasi ekstrak ketepeng cina disusun menjadi 6 taraf, yaitu : K 0 = Konsentrasi ekstrak ketepeng cina 0% K 1 = Konsentrasi ekstrak ketepeng cina 40% K 2 = Konsentrasi ekstrak ketepeng cina 50% K 3 = Konsentrasi ekstrak ketepeng cina 60% K 4 = Konsentrasi ekstrak ketepeng cina 70% K 5 = Konsentrasi ekstrak ketepeng cina 80% Jumlah ulangan yang digunakan adalah 4 (empat) kali, sehingga total unit penelitian adalah 6 taraf x 4 ulangan = 24 unit penelitian. Jumlah ulangan ditentukan berdasarkan rumus yaitu: 62 62 Dr. Ir. Kemas Ali Hanafiah, M.S, Rancangan Percobaan (Teori dan Aplikasi), Jakarta: Rajawali Pers, 2010, h. 9
35 (t-1) (r-1) 15 Keterangan: t = jumlah perlakuan r = jumlah ulangan Adapun perhitungan ulangan adalah sebagai berikut: (t 1) (r 1) 15 (6 1) (r 1) 15 5 r 5 15 5 r 15 + 5 r = r 4 r = 4 G. Prosedur Penelitian Proses penelitian ini dilakukan dalam satu tahapan, yaitu tahapan perlakuan, dengan langkah-langkah pengumpulan data sebagai berikut: 1. Menyiapkan Medium Lempeng SDA Pembuatan medium lempeng SDA secara sederhana adalah sebagai berikut: (1) Siapkan alat-alat yang bersih, kering, dan steril. (2) Buat medium Sabouraud Dextrose Agar (SDA), dengan formula: Sabouraud Dextrose Agar (SDA) bubuk 19,5 gr Aquadest.. 300 ml 63 (3) Masukkan medium ke dalam labu erlenmenyer 500 ml, kemudian panaskan sampai larutan homogen. 63 Khoirotunnisa Uswatun Hasanah, Uji Daya Antifungi Propolis Terhadap Candida albicans dan Pityrosporum ovale, Jurnal Skripsi, Surakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah, 2012, h. 34
36 (4) Siapkan sebanyak 24 buah cawan petri dan tabung reaksi. (5) Tuangkan 10 ml larutan medium Sabouraud Dextrose Agar (SDA) per cawan petri aquades 1000 ml. (6) Tutup seluruh cawan petri dengan kertas sampul, dan ikat menggunakan tali kasur. Sumbat semua tabung reaksi dengan kapas, dan masukkan ke dalam labu erlenmenyer. (7) Sterilisasikan seluruh cawan petri (24 cawan) dan aquades 1000 ml dalam autoklaf pada suhu 121 o C dengan tekanan 15 lb (pound) selama 30 menit. (8) Setelah proses sterilisasi selesai, selanjutnya bahan-bahan dibiarkan selama 2 x 24 jam. Jika medium terkontaminasi maka sterilisasi diulang kembali, sebaliknya jika medium tidak terkontaminasi (tercemar) maka medium telah siap untuk dipergunakan. 64 2. Menyiapkan Medium SDB Pembuatan medium SDB (Sabouraud Dextrose Broth) yang langkah-langkahnya sebagai berikut: 1) Siapkan alat-alat yang bersih, kering dan steril. 2) Timbang komponen medium dengan menggunakan neraca digital sesuai dengan komposisi berikut: Maltosa...40 gram Pepton...10 gram Akuades 1000 ml 65 64 Modifikasi dari. Noor Hujjatusnaini, Pengaruh Ekstrak Daun Ketepeng Cina (Cassia alata L.) Terhadap Penghambatan Pertumbuhan Trychopyton sp, Skripsi, Palangka Raya: UNPAR, 2000, h. 21-22 65 James G. Cappucino N, Sherman. Microbiologi A Laboratori Manual, California: Benjamin/ Cummings Publishing Company, Inc, 1987, h.448
37 3) Larutkan maltosa dan pepton ke dalam akuades. 4) Aduk larutan dextrosa dan pepton secara konstan dan letakkan di atas hot plate. 5) Sterilkan medium kultur cair 40 ml dalam labu Erlenmeyer menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C dengan tekanan 15 lb (pound) selama 30 menit. 6) Masukkan larutan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml per tabung setelah itu letakkan semua tabung tersebut pada rak tabung reaksi. 7) Setelah proses sterilisasi selesai, selanjutnya bahan-bahan dibiarkan selama 2x24 jam. Jika medium terkontaminasi maka sterilisasi diulang kembali, sebaliknya jika medium tidak terkontaminasi maka medium telah siap untuk dipergunakan. 66 3. Menyiapkan Biakan Murni Pityrosporum ovale Langkah-langkah dalam persiapan biakan murni Pityrosporum ovale adalah sebagai berikut: 1) Lakukan peremajaan biakan murni dengan menginokulasikan biakan murni Pityrosporum ovale pada medium lempeng SDA yang baru, lalu diinkubasikan selama 1 x 24 jam. 2) Setelah diperoleh kultur Pityrosporum ovale murni, kemudian inokulasikan pada medium miring, sehingga kultur Pityrosporum ovale mempunyai kemampuan tumbuh optimal. 3) Selanjutnya inokulasikan kultur murni Pityrosporum ovale dari medium lempeng SDA ke dalam 100 ml medium SDB secara aseptis. 66 Tim Penyusun, Petunjuk Praktikum Dasar, Purwokerto: Universitas Jendral Soedirman, 2008, h.17
38 4) Inkubasikan medium SDB yang telah diinokulasikan kultur murni selama 3 x 24 jam, karena berdasarkan uji pendahuluan yang dilakukan masa inkubasi yang optimal terhadap pertumbuhan Pityrosporum ovale yaitu 3x24 jam. Setelah itu biakan murni Pityrosporum ovale sudah siap untuk digunakan dalam penelitian. 67 4. Menyiapkan Ekstrak Daun Ketepeng Cina Langkah-langkah dalam persiapan ekstrak ketepeng cina adalah sebagai berikut: 1) Siapkan dan cuci 300 gr daun ketepeng cina yang segar sampai bersih, lalu diiris-iris kasar dengan ukuran ± 2 cm. 2) Blender irisan kasar daun ketepeng cina dengan menambahkan 1500 ml etanol 90%, sampai diperoleh suspensi daun ketepeng cina, kemudian didiamkan selama 2 jam. 3) Selanjutnya saring suspensi tersebut dengan menggunakan saputangan steril, kemudian saring kembali dengan menggunakan kertas saring. 4) Hasil saringan daun ketepeng cina kemudian dievaporasikan sampai diperoleh ekstrak daun ketepeng cina berbentuk pasta, yang kemudian dijadikan sebagai stok induk. 5) Siapkan 10 ml ekstrak daun ketepeng cina dengan konsentrasi 80%, yaitu dengan cara mencampurkan 9 ml stok induk ekstrak daun ketepeng cina dengan 2 ml akuades steril. 67 Cappucino, J G. N, Sherman, Microbiologi A Laboratori Manual, California: Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc, 1984, h.358
39 6) Siapkan 10 ml ekstrak daun ketepeng cina dengan konsentrasi 70%, 60%, 50%, 40%, dan 0% sebagai kontrol perlakuan (perhitungan sama dengan poin 5). 68 5. Pemberian Ekstrak Daun Ketepeng Cina Pada Koloni Biakan Pityrosporum ovale Langkah-langkah kerja dalam pemberian ekstrak daun ketepeng cina pada koloni Pityrosporum ovale adalah sebagai berikut: 1) Siapkan 24 cawan medium lempeng SDA, kemudian berikan kode-kode perlakuannya pada setiap cawan. 2) Siapkan paper disc dengan diameter 2 cm sebanyak 24, kemudian rendam ke dalam 5 beaker glass yang masing-masing berisi 10 ml larutan ekstrak daun ketepeng cina sesuai dengan konsentrasi perlakuannya, yaitu 40%, 50%, 60%, 70%, dan 80%. Perendaman 1 lembar paper disc juga dilakukan pada larutan tanpa perlakuan konsentrasi ekstrak (0%) yang berfungsi sebagai kontrolnya. Perendaman tersebut dilakukan selama 30 menit. 3) Goyang-goyangkan kultur cair Pityrosporum ovale secara perlahan selama 3 menit, sehingga penyebaran mikroba menjadi merata. 4) Kemudian goreskan kultur murni cair Pityrosporum ovale yang telah berumur 3 x 24 jam pada masing-masing 24 medium lempeng SDA dengan menggunakan cotton bud, sehingga diperoleh inokulan yang relatif seragam. 68 Modifikasi dari. Noor Hujjatusnaini, Pengaruh Ekstrak Daun Ketepeng Cina (Cassia alata L.) Terhadap Penghambatan Pertumbuhan Trychopyton sp, Skripsi, Palangka Raya: UNPAR, 2000, h. 23-24
40 5) Selanjutnya letakkan masing-masing 1 paper disc yang telah direndam selama 30 menit tersebut ke bagian tengah-tengah permukaan medium lempeng SDA secara aseptis sesuai dengan kode perlakuannya sebanyak 24 cawan. 6) Kemudian simpan 24 cawan petri ke dalam inkubator pada suhu 30 o C. 7) Lakukan pengambilan data pada saat kultur Pityrosporum ovale berumur 2 x 24 jam, 3 x 24 jam, dan 4 x 24 jam. H. Teknik Pengumpulan Data Pengambilan data hasil penelitian dilakukan pada saat kultur Pityrosporum ovale yang berjumlah 24 cawan petri berumur 2x24 jam, 3x24 jam, dan 4x24 jam setelah pemberian perlakuan. Data diambil pada semua unit penelitian, yaitu berupa hasil pengukuran lebar (dalam satuan mm) antara sisi terluar paper disc yang mengandung ekstrak perlakuan dengan koloni Pityrosporum ovale di permukaan medium lempeng SDA. Data yang diukur adalah jarak koloni tumbuh Pityrosporum ovale yang terdekat dengan paper disc. I. Teknik Analisis Data Teknik analisis data yang digunakan pada penelitian ini adalah menggunakan teknik Analisis Variasi (ANAVA), yang langkah-langkahnya dapat disederhanakan: 1. Menyusun data ke dalam tabel Data yang dikumpulkan seluruhnya dimasukkan ke dalam tabel data hasil penelitian, seperti di bawah ini:
41 Tabel 3.1 Contoh Tabel Data Hasil Pengamatan Perlakuan Ulangan 1 2 3 Total X K 0 K 1 K 2 K 3 K 4 K 5 2. Menghitung Jumlah Kuadrat Faktor korelasi (FK) = ( X total ) 2 N JK Total = ( X ) FK JK perlakuan = ( ) ( ) ( ) ( ) FK JK Galat = JK total JK perlakuan 3. Menentukan Derajat bebas (db) Db perlakuan = t 1 = 6-1= 5 Db Galat = t (r t ) = 6 (4-1) = 18 Db Total = ( t. r ) 1 = (6. 4) - 1= 23 4. Menentukan Kuadrat Tengah (KT) KT perlakuan = KT Galat =
42 5. Menghitung Harga F hitung F hitung = 6. Menghitung harga koefisien Keragaman (KK) Koefisien keragaman (KK) berfungsi untuk mengukur besarnya variasi data hasil penelitian, yang dinyatakan dalam satuan persen (%). Makin besar harga KK, maka variasi data makin besar pula, begitu pula sebaliknya. Rumus untuk menghitungnya adalah sebagai berikut: KK = x 100% Hubungan nilai KK dan macam uji beda yang sebaiknya dipakai, yaitu: a. Jika KK besar, (minimal 10% pada kondisi homogen atau minimal 20% pada kondisi heterogen), uji lanjutan yang sebaiknya digunakan adalah uji Duncan, karena uji ini dapat dikatakan yang paling teliti. b. Jika KK sedang, (antara 5-10% pada kondisi homogen atau antara 10-20% pada kondisi heterogen), uji lanjutan yang sebaiknya dipakai adalah uji BNT (Beda Nyata Terkecil) karena uji ini dapat dikatakan juga berketelitian sedang. c. Jika KK kecil (maksimal 5% pada kondisi homogen atau maksimal 10% pada kondisi heterogen), uji lanjutan yang sebaiknya dipakai adalah uji BNJ (Beda Nyata Jujur) karena uji ini tergolong kurang teliti. 69 69 Kemas Ali Hanafiah, Rancangan Percobaan & Teori Aplikasi, Palembang: USP, 2001, h..34
43 7. Membuat Tabel Ringkasan Analisis Variansi Tabel 3.2 Contoh Tabel Ringkasan Analisis Variansi Sumber keragaman Perlakuan Galat Total Db JK KT F-Hitung F-Tabel 5% 1% Kriteria Pengujian Hipotesis Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini disusun dalam bentuk hipotesis statistik, yaitu: Ho = Perlakuan pemberian konsentrasi ekstrak daun ketepeng cina (Cassia alata L.) tidak mempunyai pengaruh yang nyata terhadap pertumbuhan Pityrosporum ovale. H 1 = Perlakuan pemberian konsentrasi ekstrak daun ketepeng cina (Cassia alata L.) mempunyai pengaruh yang nyata terhadap pertumbuhan Pityrosporum ovale. Pengujian hipotesis dilakukan berdasarkan perbandingan antara F- hitung dengan F-tabel pada taraf signifikan 5% dan 1%, dengan kriteria sebagai berikut: Hipotesis statistik ini diuji dengan cara membandingkan harga F hitung dengan F tabel. Adapun kriteria pengujian hipotesis adalah sebagai berikut :
44 1) Jika F hitung < F tabel 5%, maka H o diterima, sedangkan H 1 ditolak dan dinyatakan bahwa perlakuan yang diberikan tidak berpengaruh nyata dan tidak dilanjutkan dengan uji Duncan. 2) Jika harga F tabel 1% > F hitung > F tabel 5 % berarti H 1 diterima, sedangkan H 0 ditolak dan dinyatakan bahwa perlakuan yang diberikan berpengaruh nyata. 3) Jika harga F hitung > F tabel 1 % berarti H o ditolak, sedangkan H 1 diterima dan dinyatakan bahwa perlakuan yang diberikan berpengaruh nyata atau sangat nyata. Uji lanjut Apabila F tabel 1% > F hitung > F tabel 5 % maka dapat dinyatakan perlakuan yang diberikan berpengaruh nyata, sehingga dapat dilanjutkan dengan uji Duncan 5%, dan jika F hitung > F tabel 1% maka dapat dinyatakan perlakuan yang diberikan berpengaruh sangat nyata, sehingga dapat dilanjutkan dengan uji Duncan 1%. DMRT (Duncan s Multiple Range Test) : =tα/2 ; dbs x 70 70 Kemas Ali Hanafiah, Rancangan Percobaan & Teori Aplikasi, Palembang: USP, 2001, h. 81
45 No. J. Jadwal Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai dengan bulan Mei 2013. Jadwal kegiatan penelitian disusun dalam Tabel 3.3 sebagai berikut: Tabel 3.3 Jadwal Kegiatan Penelitian Kegiatan 1. Perijinan persiapan penelitian 2. Konsultasi persiapan penelitian 3. Persiapan alat dan bahan Bulan Maret April Mei Juni Juli Agustus September 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 x x x x x 4. Pelaksanaan penelitian x x x x 5. Pengambilan data x x 6. Analisis data x x x 7. Pembahasan data x x x x x x x 8. Penyusunan laporan x x x 9. Ujian munaqasah x