Temu Teknis Nasional Tenaga Fungsional Perlanian 2006 PENINGKATAN EFEKTIVITAS MEDIA ISOLASI KHAMIR CONTOH KECAP DENGAN PENAMBAHAN KECAP WAWAN SUGIAWAN Balai Penelitian I'eteriner, Jl. R. E. Martadinata No. 30, Bogor 16114 RINGKASAN. Komposisi media sangat menentukan keberhasilan dalam isolasi khamir. Beberapa media komersial yang tersedia tidak selalu memberikan hasil yang memuaskan dan memerlukan beberapa modifikasi untuk meningkatkan efektifitasnya. Pada karya ilmiah ini akan ditampilkan modifikasi media komersial untuk meningkatkan populasi khamir yang dapat terisolasi. Media komersial yang digunakan adalah sabouraud dextrose agar (SDA). Modifikasi media dilakukan dengan menambahkan kecap asin ke dalam SDA dengan konsentrasi 5, 10, 15 dan 20% Perlakuan yang sama juga dilakukan pada kecap manis dan sebagai sebagai kontrol digunakan SDA tanpa penambahan apapun. Contoh kecap diinokulasikan pada cawan petri yang masing-masing berisi SDA atau SDA yang sudah ditambah kecap kemudian diinkubasikan pada suhu 25 dan 37 C selama dua hari. Koloni yang tumbuh dihitung. Hasil perlakuan menunjukkan bahwa khamir hanya tumbuh pada suhu inkubasi 25 C. Koloni khamir pada media SDA dengan penambahan kecap tumbuh lebih banyak daripada media SDA saja. Penambahan kecap manis memberikan keberhasilan isolasi yang lebih besar daripada penambahan kecap asin, sedangkan konsentrasi kecap manis yang memberikan hasil paling baik adalah 10%. Hasil tersebut menunjukkan bahwa penambahan kecap pada media dapat meningkatkan efektifitas dalam isolasi khamir terutama pada contoh kecap. Kata kunci : Isolasi, media komersial, SDA, khamir, kecap. PENDAHULUAN Berbagai macam media digunakan untuk menumbuhkan cendawan balk kapang maupun khamir. Beberapa ahli mikologi mengembangkan beberapa tipe media berdasarkan pengalaman dan tipe cendawan yang akan ditumbuhkan. Media menjadi sesuatu yang penting karena akan mempengaruhi morfologi, warna koloni dan jumlah koloni yang dapat terisolasi. Pengayaan medium kadang diperlukan untuk isolasi khamir dari alam (LODDER, 1974) maupun mikroorganisme yang lain. Medium yang diperkaya dengan mineral tertentu untuk Botrytis cinerea dilaporkan dapat meningkatkan jumlah koloni yang hidup pada media cawan petri (EDWARDS AND SEDDON. 2001). Pembuatan media potato dextrose agar (PDA) yang diasamkan denga juice citrus digunakan untuk isolasi cendawan yang tahan asam. Beberapa khamir seperti Saccharonzyces cerevisiae dan Zygosaccharomyces spp. pada beberapa produk tertentu dapat menjadi khamir yang tidak diinginkan dan media PDA yang telah diasamkan (APDA : Acidicfied potato dextrose agar) merupakan media yang disarankan untuk screening khamir tersebut (GOODRICH AND NARCISO, 2001). Media komersial khamir diantaranya adalah sabaroud dextrose agar (SDA) yang komposisinya sudah diatur dan ditakar dengan mengacu pada kebutuhan dasar hidup kebanyakan khamir pada habitatnya di alam. Akan tetapi adakalanya dengan menggunakan media SDA tersebut, beberapa jenis khamir tidak berhasil diisolasi dari contoh atau terisolasi tetapi tidak tumbuh subur seperti yang terjadi ketika mengisolasi khamir dari contoh kecap. Kecap adalah suatu bahan pangan yang berfungsi sebagai penyedap masakan, dibuat dari bahan kedelai yang di dalam proses pembuatannya salah satunya meliputi proses fermentasi dengan menggunakan kapang Aspergillus sp., Rhizopus sp. dan khamir Zygosaccharomyces sp. serta bakteri Lactobacillus sp. (ANONYMOUS, 2006). Kedelai hasil fermentasi berupa semacam tempe, setelah dikeringkan lalu direndam dalam larutan garam 20%, sehingga hanya mikroba yang tahan garam saja yang tumbuh dalam rendaman kedele, seperti khamir Zygosaccharomyces dan bakteri Lactobacillus sp. Khamir yang berhasil 76
diisolasi dari contoh kecap dengan menggunakan media SDA, sedikit sekali populasinya. Hal ini tentunya dikarenakan komposisi media tersebut kurang dapat memenuhi kebutuhan hidup khamir yang ada pada contoh kecap. Untuk mengatasi keterbatasan kemampuan media SDA dalam isolasi khamir dari contoh kecap tersebut, maka diperlukan suatu modifikasi media guna menyesuaikan dengan kondisi contoh. Untuk memodifikasi media secara sintetik sudah pasti sangat rumit karena disamping harus melakukan analisa contoh yang membutuhkan kecermatan dan waktu yang cukup lama, juga diperlukan beberapa bahan kimia tambahan yang harganya tidak murah. Karya tulis ini akan menyajikan cara memodifikasi media komersial SDA untuk isolasi contoh kecap dengan cara lebih cepat, sederhana, dan murah. Modifikasi yang dilakukan adalah menambahkan kecap ke dalam media MA dalam berbagai konsentrasi sebagai media untuk isolasi contoh kecap. Tujuan dari perlakuan konsentrasi kecap yang berbeda-beda dalam media SDA adalah untuk mengetahui peningkatan efektivitas media isolasi khamir dari contoh kecap. Kemudian untuk mengetahui kandungan koloni khamir per ml contoh kecap, maka digunakan metode pengenceran (THOMPSON, 1969). Media MATERI DAN METODE Media komersial yang digunakan adalah SDA. Pembuatan media tersebut dilakukan dengan melarutkan SDA sebanyak 65 g dalam 1 1, air suling steril. Media modifikasi dibuat dengan menambahkan kecap manis pada media SDA dengan konsentrasi 5, 10, 15, dan 20% dan dilarutkan sampai homogen dalam I L air suling steril. Perlakuan yang sama dilakukan pada pembuatan media dengan penambahan kecap manis. Media diukur phnya dan ditentukan menjadi ph 5,5 dengan penambahan HCI atau NaOH dan kemudian dipanaskan dalam air mendidih. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121 C selama 20 menit, kemudian ke dalam media tersebut ditambahkan larutan antibiotik sebanyak 20 ml per liter yang mengandung 50 mg chloramphenicol. Setelah itu media dimasukkan ke dalam penangas air pada suhu 50-55 C untuk mempertahankan media agar tidak beku. Inokulasi contoh Contoh kecap dilarutkan dalam air suling steril dan diencerkan menurut THOMPSON (1969). Satu ml contoh dilarutkan dalam 9 ml air suling steril dalam tabung lalu dikocok dengan vortex hingga homogen. Dari larutan 10-1 diambil I ml untuk diencerkan lagi secara bertahap hingga diperoleh larutan 10-2 dan 10-3. Dari masing-masing contoh hasil pengenceran dituangkan ke dalam cawan petri kosong steril sebanyak I ml per cawan petri. Setiap jenis media dituangkan ke dalam cawan petri yang sudah berisi contoh sebanyak 15-20 ml per cawan petri. Dari setiap jenis media dibuat 6 cawan petri biakan contoh untuk perlakuan yaitu 3 tingkat pengenceran contoh dan 2 ukuran suhu inkubasi. Setiap cawan petri diberi kode/label perlakuan. Selanjutnya biar kan seluruh media biakan membeku, kemudian diinkubasikan pada suhu 25 dan 37 C selama 2 hari. Biakan contoh diperiksa dan dihitung jumlah koloni yang tumbuh. Dari data hasil pengamatan jumlah koloni yang tumbuh, maka dihitung kandungan koloni tiap ml contoh dengan menggunakan rumus penghitungan colony forming unit (cfu) (U.S. FOOD & DRUG ADMINISTRATION. 2001) sebagai berikut : N = (C/[(l x n 1) + (0,1 x n2)] x (d) N = jumlah koloni per ml atau gram contoh C = koloni n1 = jumlah cawan pertama yang koloninya dapat dihitung n2 = jumlah cawan kedua yang koloninya dapat dihitung d = pengenceran pada cawan pertama yang dapat dihitung 77
HASIL DAN PEMBAHASAN Dari hasil pengamatan setelah 2 hari inkubasi memperlihatkan bahwa semua biakan contoh kecap hanya tumbuh pada suhu 25 oc saja. Koloni khamir yang tumbuh pada semua media perlakuan dengan penambahan kecap manis jumlahnya jauh lebih banyak dibanding yang tumbuh pada media kontrol. Menurut Anonymous (2006), kecap dibuat melalui proses fermentasi oleh kapang Aspergillus sp., Rhizopus sp. dan khamir Zygosaccharomyces sp. serta bakteri Lactobacillus sp. dengan penambahan gula merah dan beberapa macam rempah-rempah. Mikroba tersebut dapat merombak protein menjadi asam amino, komponen rasa dan aroma serta menghasilkan asam. Kondisi kecap yang demikian diduga mampu menyediakan nutris penting yang tidak terdapat dalanl SDA. Pengayaan media tersebut akan memberikan peluang bagi khamir yang kurang tumbuh subur pada media SDA menjadi - tumbuh lebih baik. Gula pada gula merah diduga juga berbeda dengan dextrose pada media SDA sehingga memberikan hash yang berbeda. Populasi koloni khamir tertinggi diperlihatkan pada medium SDA dengan penambahan 10% kecap manis yaitu dengan 30.636 cfu/ml contoh dan jauh lebih tinggi dibanding media SDA kontrol yaitu 10.909 cfu/ml contoh atau mengalami peningkatan sebanyak 181%. Peningkatan kesuburan media perlakuan dengan penambahan kecap asin hanya efektif pada konsentrasi 5 dan 10% saja yaitu memperlihatkan cfu/ml contoh sebesar 25,455 dan 18,364 atau peningkatan sebanyak 133 dan 68% (Tabel 1). Penambahan kecap manis kurang atau lebih dari 10% cenderung menurunkan efektivitas media. Penurunan tersebut terjadi mungkin disebabkan oleh konsentrasi gula yang terlalu sedikit atau terlalu banyak dalam SDA yang diperkaya dengan kecap manis 5, 15, dan 20%. Menurut Al-Doory (1924), bahwa konsentrasi gula yang ideal untuk media khamir SDA adalah 4%. Penambahan kecap asin ke dalam SDA sebanyak 15 dan 20% tidak efektif (Grafik 1). 35.000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000 0 0% 5% 10% 15% 20% Penambahan Kecap -~SDAO% (Kontrol) --4w- SDA + Kecap Asin --SDA + Kecap Manis Grafik 1. Efektifitas persentase penambahan kecap asin dan manis ke dalam media SDA dalam isolasi khamir dari contoh kecap 78
Tabel 1. Data hasil pengamatan pertumbuhan koloni khamir pada berbagai perlakuan setelah dua hari inkubasi pada suhu 25 C Kode Perlakuan E koloni tumbuh 10-2 10- ' E koloni per ml contoh (cfu) Persentase naik/turun SDAO% (Kontrol) 120 0 10,909 SDA5%A 278 2 25,455 133 SDA5%M 266 17 25,727 136 SDA 1O%A 188 14 18,364 68 SDA1O%M 322 15 30,636 181 SDA15%A 103 2 9,545-13 SDA15%M 275 4 25,364 133 SDA20%A 49 3 4,727-57 SDA20%M 243 8 22,818 109 Keterangan : 10' 2, 10" 3 = Tingkatan pengenceran contoh dalam air suling steril ; Cfu = Colony forming unit, merupakan hasil hitungan dengan menggunakan rumus cfu ; SDA = Sabouroud Dextrose Agar ;..% = Persentase kecap yang ditambahkan ke dalam media SDA ; A = Kecap asin ; M = Kecap man is KESIMPULAN DAN SARAN. Modifikasi media dengan penambahan kecap ke dalam media SDA untuk isolasi khamir dari contoh kecap dapat meningkatkan efektivitas media untuk isolasi khamir dari contoh kecap Penambahan kecap manis sebanyak 10% ke dalam media SDA untuk isolasi khamir dari contoh kecap sangat efektif yaitu dapat meningkatkan hasil isolasi sebanyak 181% sedangkan penambahan kecap manis kurang atau lebih dari 10% efektivitasnya cenderung menurun. Penambahan kecap asin 5% ke dalam media SDA cukup efektif walaupun masih jauh dibawah kecap manis dan penambahan lebih dari 5% cenderung menurunkan efektivitasnya, bahkan menjadi tidak efektif pada konsentrasi diatas 10%. Penurunan efektivitas tersebut dimungkinkan karena pengaruh kelebihan atau kekurangan kadar gula atau garam yang terkandung di dalam kecap. Untuk mengetahui sejauh mana pengaruh dari kadar gula atau garam tersebut diperlukan suatu penelitian lebih lanjut. Selain efektivitas yang tinggi, proses modifikasi media inipun cukup sederhana, murah, dan cepat. Prinsip modifikasi media isolasi dengan cara menambahkan material yang sejenis contoh seperti kecap ke dalam media komersial, diharapkan dapat dicobakan untuk isolasi mikroba dari contoh yang lain. UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih disampaikan kepada ibu Eny Kusumaningtyas, SSi, MSc. atas pemberian keleluasaan dan bimbingan dalarn melakukan uji coba modifikasi media ini serta atas pengarahan dan koreksinya dalam pembuatan karya tulis ini. DAFTAR BACAAN AL-DOORY, Y. 1981. Laboratory Medical Mycology. Lea & Febiger. Philadelphia. 1981. him. 372. ANONYMOUS. 2006. littn ://Nvikincdia.orp/wiki/Kecap. 12-04- 2006. 79
EDWARDS, S.G. AND B. SEDDON. 2001. Selective media for the specific isolation and enumeration of Botrytis cienerea conidia. Letter in Applied Microbiology. Vol. 32. pp. : 63-66. February 2001. GOODRICH, R.M. AND J.A. NARCISO, 2001. Method for yeast determination in fruit juice. IFT Annual Meeting-New Orleans, Lousiana LODDER, J. 1974. The Yeast. A taxonomic study. North-Holland Pub. Co. Amsterdam. 1974. THOMPSON, J.C. 1969. Techniques for isolation of the common pathogenic fungi. 1. Deep. Mycosis and Yeast Medium. The Technical Journal of Veterinary Laboratories. Vol. 2. No. 3. August 1969. U.S. Food & Drug Administration. 2001. Bacteriological Analytical Manual. Anaerobic plate count. 80