III. METODE PENELITIAN A. Alat dan Bahan Materi penelitian berupa larva dari nilem umur 1 hari setelah menetas, yang diperoleh dari pemijahan induksi di Laboratorium Struktur Perkembangan Hewan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. Bahan penelitian disajikan pada Lampiran 1. Peralatan yang digunakan selama penelitian disajikan pada Lampiran 1. B. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan Hewan, Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman. Penelitian ini telah dilakukan selama 6 bulan dimulai dari bulan Mei-Oktober 2014. C. Rancangan Percobaan Penelitian dilaksanakan secara eksperimental dengan dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola Split-plot, sebagai petak utama ( Main plot) adalah temperatur terdiri dari temperatur ruang (T1), 27±1 o C (T2), dan 30±1 o C (T3). Anak Petak (Sub plot) berupa konsentrasi metiltestosteron dalam medium terdiri dari kontrol (M1), 1,6 nm (M2), 16 nm (M3), dan 32 nm (M4), dengan demikian terdapat 12 kombinasi perlakuan yaitu T1M1, T1M2, T1M3, T1M4, T2M1, T2M2, T2M3, T2M4, T3M1, T3M2, T3M3, T3M4. Setiap kombinasi perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Setiap unit ulangan berisi 20 ekor larva ikan nilem umur 1 hari setelah menetas, dengan demikian diperlukan 720 ekor larva ikan nilem. 1. Variabel penelitian Variabel yang diamati terdiri dari variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebas adalah temperatur media dan kadar metiltestosteron dalam media. Variabel tergantung adalah perkembangan sirip larva dan post larva ikan nilem dengan parameter panjang dan luas sirip serta diferensiasi sirip (yang dievaluasi dengan pewarnaan alizarin red), sebagai data pendukung diukur panjang tubuh post larva. 9
D. Cara Kerja 1. Persiapan Bak Pemeliharaan Pada Bak pemeliharaan yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah Bak dengan ukuran 10 x 5 x 15 cm 3, diisi dengan air hingga volume 1 liter dan diaerasi. Jumlah bak pemeliharaan yang digunakan adalah 36 buah. Setiap bak pemeliharaan akan diisi larva 20 ekor ikan nilem. Sebelum digunakan bak pemeliharaan dicuci, kemudian diisi dengan methyllene blue untuk pencegahan adanya parasit dan jamur agar selama penelitian diharapkan ikan tetap hidup dan sehat. 2. Pembuatan Bahan Penelitian a. Pembuatan Medium Larutan Hormon Metiltestosteron Pembuatan medium larutan hormon Metiltestoteron dilakukan dengan membuat larutan stok metiltestosteron dengan cara melarutkan 0,3 mg ke dalam 100 ml etanol 70%. Untuk pembuatan medium dengan kadar 1,6nM diambil 0,16 ml larutan stok dilarutkan dalam 1L air yang sebelumnya sudah diambil 0,16 ml. Selanjutnya untuk kadar 16 nm dan 32 nm, sama seperti kadar metiltestosteron 1,6 nm, namun bedanya hanya jumlah stok yang dilarutkan yakni untuk 16 nm diambil 1,6 ml, sedangkan 3,2 ml untuk kadar 32 nm. b. Pembuatan Larutan Alizarin Red Pembuatan untuk 75 ml larutan stok alizarin red dilakukan dengan cara melarutkan 0,06 g bubuk alizarin red ke dalam 6 ml asam asetat glasial sampai jenuh, dari larutan tersebut diambil 5 ml untuk dicampurkan dengan gliserin PA sebanyak 10 ml, kemudian ditambahkan alkohol hidrat aquosa 60 ml, sehingga jadilah larutan stok alizarin red 75 ml. Larutan alizarin red yang dapat digunakan adalah dengan mengambil 75 ml larutan stok dilarutkan ke dalam 75 ml KOH 2%. 10
c. Pembuatan Larutan Penjernih 1) Larutan Penjernih A (komposisi 100 ml) KOH 4%... Aquades... 20 ml 3 ml 77 ml 2) Larutan Penjernih B (komposisi 100 ml) KOH 4%... Aquades... 50 ml 3 ml 47 ml 3) Larutan Penjernih C (komposisi 100 ml) Aquades... 75 ml 25 ml 3. Pengadaan Larva Larva yang digunakan adalah larva umur 1 hari setelah menetas, sehingga harus dilakukan pemijahan atau fertilisasi untuk mendapatkan larva. Induk ikan jantan dan betina yang matang gonad disiapkan, keduanya diinduksi menggunakan 0,5 ml/kg berat badan GnRH analog. Induk betina yang telah diinduksi dipasangkan dengan induk jantan, setiap akuarium diisi dengan satu induk betina dan satu induk jantan. Delapan sampai sepuluh jam setelah diinduksi kemudian distriping untuk mendapatkan milt dari induk jantan dan sel telur dari induk betina. Dilakukan pemijahan buatan atau fertilisasi buatan, dengan cara mencampurkan sel telur dan milt di dalam baskom kemudian diberi akuades untuk aktivasi spermatozoa, kemudian dicampurkan dengan cara digoyangkan baskomnya selama 2 menit. Setelah 2 menit pencampuran, sel telur dipisahkan dengan saringan, kemudian ditetesi sedikit air dengan tujuan agar sisa dari plasma spermatozoa terbuang, kemudian dimasukkan ke dalam akuarium pemeliharaan. 11
4. Pemeliharaan Larva ikan Nilem yang pertama kali menetas dipelihara pada medium metiltestosteron dengan konsentrasi 1,6 nm, 16 nm, 32 nm dan kontrol pada temperatur yang berbeda-beda terdiri dari temperatur ruang, 27 o C, dan 30 o C. Larva dipelihara selama 5 minggu, dengan setiap hari diberi pakan dan 2 hari sekali ganti medium pemeliharaan. Pakan diberikan setiap hari pada pukul 08.00 dan 16.00 serta medium diganti setiap 2 hari sekali. 5. Pengamatan a. Pengukuran Temperatur Pengukuran temperatur dilakukan setiap hari selama pemeliharaan, pengukuran ini meliputi pengukuran temperatur udara dan temperatur medium sebanyak 3 kali yakni pagi, siang dan sore. b. Pengukuran Panjang dan Luas Sirip ikan Nilem diukur panjang dan luasnya menggunakan eye piece/ graticle yang telah dikalibrasi. Pengukuran dilakukan setiap hari sejak hari pertama penetasan hingga hari ketujuh dilanjutkan setiap minggu hingga minggu kelima. Sirip yang diukur meliputi sirip pectoral ( pinnae pectoralis), abdominal ( pinnae abdominalis), dorsal ( pinna dorsalis), anal ( pinna analis) dan caudal ( pinna caudalis). Sampel yang diukur adalah 11 pada setiap kombinasi perlakuan, sehingga total sampel yang diukur adalah 11x36= 396 sampel. Hasil pengukuran kemudian ditabulasikan. c. Pengukuran Panjang Tubuh Larva dan post larva Ikan Nilem diukur panjang tubuhnya menggunakan milimeter blok dengan ketelitian 1 mm. d. Proses Diferensiasi Sirip dengan Metode Alizarin Red Proses diferensiasi sirip diamati dengan menggunakan metode Alizarin Red, dengan tujuan untuk melihat proses kalsifikasi jari-jari siripnya. Langkah dalam proses pewarnaannya adalah larva ikan difiksasi dalam alkohol 96% selama 12 jam, kemudian direndam dalam akuades selama 10 menit, lalu direndam dalam KOH 1% selama 25 menit, larva selanjutnya direndam dalam larutan pewarna alizarin red selama 2-4 jam, dan dicuci dalam larutan penjernih A, B, C masing-masing selama 25 menit. Pengamatan dilakukan di 12
bawah mikroskop cahaya. Pada minggu pertama dilakukan setiap hari pewarnaan dengan alizarin red, pada minggu kedua sampai minggu kelima dilakukan dengan interval 7 hari. Proses diferensiasi sirip dievaluasi dengan melihat sirip apa saja yang telah terbentuk dan jari-jari sirip yang telah terkalsifikasi. Sampel yang diwarnai adalah 11 pada setiap kombinasi perlakuan, sehingga total sampel yang diwarnai adalah 11x36= 396 sampel. E. Analisis Data Data penelitian terdiri atas 2 data yakni data diferensiasi dan data pertumbuhan sirip. Data diferensiasi dianalisis secara deskriptif sedangkan data pertumbuhan sirip dianalisis menggunakan ANOVA dua arah dengan tingkat signifikansi 0,05. Apabila hasil Anova menunjukkan p<0,05 maka uji dianjutkan dengan BNT. 13