PEMBAHASAN Isolat FR1, FR2, HF7 dan LF6 adalah kelompok bakteri fermentatif, tumbuh pada medium denitrifikasi yang mengandung nitrat baik secara anaerob maupun aerob. Rusmana dan Nedwell (2004), melaporkan bahwa proses reduksi nitrat menjadi amonium disimilatif (DNRA) dilakukan oleh kelompok bakteri dengan tipe metabolisme fermentatif. Lebih lanjut White (2000), menyatakan bahwa proses fermentasi memperoleh energi melalui fosforilasi tingkat substrat yang terjadi di sitosol menggunakan bahan organik seperti glukosa, asetat, dan laktat sebagai elektron dan sumber karbon. Sedangkan respirasi anaerob memperoleh energi melalui fosforilasi oksidatif pada membran sel menggunakan senyawa organik seperti nitrat, sulfat, atau fumarat sebagai penerima elektron terakhir pengganti oksigen. Melihat kemampuan dari masing-masing isolat untuk tumbuh secara aerob dan anaerob diperkirakan keempat isolat ini memiliki enzim-enzim respirasi oksidatif dan nitrat reduktase untuk proses respirasinya. Densitas sel keempat isolat pada sumber karbon asetat, suksinat, glukosa dan gliserol, secara umum menunjukkan pertumbuhan yang sangat baik. Pertumbuhan sel pada asetat sebagai sumber energi rata-rata tidak bagus dibandingkan dengan suksinat, glukosa, dan gliserol karena bakteri akan memanfaatkan asetat melalui metabolisme siklus glioksilat. Siklus glioksilat melakukan rute yang sama dengan siklus asam sitrat. Akan tetapi, terdapat jalan pintas, yaitu isositrat tidak diubah menjadi oksalosuksinat, tetapi dipecah menjadi glioksilat dan suksinat (Purwoko 2007). Bakteri lebih cenderung menggunakan sumber karbon yang mudah untuk di gunakan menghasilkan energi tinggi agar lebih efisien. Glukosa sebagai sumber karbon ternyata lebih efisien bagi bakteri karena glukosa akan masuk melalui jalur glikolisis kebentuk asam piruvat membentuk asetil koa baru masuk ke siklus krebs, sehingga menghasilkan energi cukup tinggi (White 1995). Densitas sel isolat-isolat sangat fluktuatif, kondisi ini diduga karena sensitivitas sistem nitrat reduktase terhadap kondisi aerob dan anaerob berbeda dari setiap isolat. Keempat isolat lebih cenderung memanfaatkan oksigen sebagai
34 akseptor elektron pada saat medium aerob. Disisi lain keberadaan akseptor elektron nitrat dapat menimbulkan interaksi dan berpengaruh terhadap jalur metabolisme oksidatif. Nitrat dapat dimanfaatkan sebagai akseptor elektron alternatif pada saat kondisi anaerob. Selain itu reduksi nitrat oleh enzim Nap dapat berlangsung sebagai pembuangan kelebihan tenaga pereduksi pada transfer elektron aerobik (Carter et al. 1995). Isolat FR2 paling bagus tumbuh pada medium suksinat sebagai sumber karbon dibanding isolat yang lain. Isolat FR2 diduga memiliki enzim nitrat reduktase periplasma (Nap) lebih dominan. Aktivitas enzim-enzim respirasi oksidatif lebih dominan dari pada enzim nitrat reduktase, karena enzim Nap berfungsi sebagai penyeimbang regulasi redoks pada transfer elektron aerobik, dan energi yang dihasilkan dari aktivitas enzim Nap kecil (Ricardson et al. 2001). Proses tersebut menyebabkan pertumbuhan FR2 lebih bagus dalam kondisi aerob dengan kerapatan sel 0,80. Hal ini sesuai dengan awal isolasi isolat FR2. Pada saat diisolasi isolat FR2 tumbuh baik pada medium yang kadar nitrat tinggi yaitu 2 mm (Marnis 2008). Pada sumber karbon yang lebih kompleks seperti glukosa (C 6 H 12 O 6 ), suksinat (C 4 H 6 O 4 ), dan gliserol (C 3 H 8 O 3 ) perolehan energi melalui proses reduksi nitrat diduga kurang efektif karena ketiga sumber karbon tersebut akan di urai melalui siklus glikolisis dan siklus kreb yang akan menghasilkan NADH dan bakteri fermentatif yang menggunakan nitrat sebagai akseptor elektron tentu akan menyediakan akseptor elektron untuk menerima elektron dari NADH. Disamping nitrat, sumber akseptor alternatif lain selain oksigen diantaranya Fe 3+, Mn 4+, Trimethylamine N oxide (TMAO), Dimethyl Sulfo oxide (DMSO), sulfat, fumarat (Purwoko 2007). Oksidasi molekul glukosa pada sistem metabolisme aerob akan berlangsung melalui lintasan glikolisis dan dilanjutkan dengan oksidasi piruvat menjadi CO 2 melalui siklus TCA. Gliserol akan masuk ke dalam lintasan glikolisis melalui pembentukan gliseraldehida-3-fosfat. Sedangkan asetat akan masuk ke dalam siklus TCA setelah diubah menjadi asetil-coa (Prescott et al. 2000). Oksidasi akan menghasilkan ATP, NADH, dan FADH 2. Perolehan energi yang lebih banyak akan mendukung pertumbuhan sel menjadi lebih bagus.
35 Isolat HF7 diduga memiliki enzim Nar yang lebih dominan. Pada saat inkubasi anaerob kandungan nitrat medium tinggi dan aktivitas enzim Nar tinggi. Sistem respirasi nitrat dominan, sehingga pada kondisi anaerob laju pertumbuhannya rendah hanya 0,12 (620 nm), karena energi yang dihasilkan dari respirasi nitrat lebih rendah. Sebaliknya pada saat kondisi aerob laju pertumbuhan sel HF7 lebih tinggi dengan kerapatan sel 0,51 (620 nm), karena dalam kondisi aerob pada tahap awal inkubasi digunakan oksigen sebagai akseptor elektron, energi yang dihasilkan jauh lebih tinggi. Pada saat kondisi aerob pada medium, enzim Nar menggantikan proses pembentukan ATP. Enzim Nar mempunyai transmembran proton motive force (PMF) tempat terjadinya sintesis ATP (Moreno- Vivian et.al 1999). Proses pergantian sistem respirasi oksidatif ke respirasi anaerob reduktif diduga diatur oleh sistem sensor regulator seperti pada Escherichia coli (Purwoko 2007). Hasil uji nitrat (NO - 3 ) tahap seleksi, keempat isolat dapat mereduksi nitrat pada sumber karbon asetat, suksinat, glukosa dan gliserol. Keempat isolat dapat menggunakan akseptor elektron nitrat. Penggunaan nitrat sebagai akseptor elektron dipengaruhi akan kebutuhan energi dari hasil metabolisme sumber karbon. Sumber karbon yang menghasilkan energi tinggi ternyata tidak baik digunakan untuk aktivitas mereduksi nitrat, demikin juga dalam kondisi aerob dapat mempengaruhi aktivitas reduksi nitrat. Hal ini dapat terlihat dari kecenderungan reduksi nitrat yang terjadi secara aerob lebih rendah dibanding reduksi nitrat dalam kondisi anaerob. Penelitian yang dilakukan oleh Mardiati (2009), memperlihatkan bahwa reduksi nitrat dalam kondisi anaerob berbanding terbalik dengan penambahan konsentrasi oksigen. Sampel dengan konsentrasi udara saturasi 100% (kondisi aerob) menghasilkan reduksi nitrat lebih sedikit. Perbedaan kemampuan mereduksi nitrat pada semua isolat disebabkan oleh adanya perbedaan aktivitas masing-masing isolat. Selain itu perbedaan kadar nitrat yang direduksi pada masing-masing isolat menunjukkan banyaknya elektron yang dapat diperoleh pada oksidasi senyawa karbon yang tersedia dalam medium karena kelompok bakteri ini menggunakan nitrat sebagai penerima elektron terakhir pada kondisi anaerob. Elektron yang diperoleh dari oksidasi senyawa
36 karbon tersimpan pada molekul NADH dan FADH 2 yang berperan sebagai donor elektron pada rantai respirasi (Madigan et al. 2009; White 2000). Reduksi nitrat akan terganggu dengan adanya oksigen. Diduga oksigen menghambat reduksi nitrat dengan 3 cara yaitu menekan ekspresi gen yang mensintesis sistem nitrat reduktase, mengganggu enzim nitrat reduktase yang telah terbentuk dan mengalihkan aliran elektron dari sistem respirasi nitrat ke sistem respirasi oksigen (Hernandez dan Rowe 1988). Sensitivitas sistem nitrat reduktase tiap jenis bakteri dalam kondisi aerob dan anaerob berbeda. Hasil penelitian Su et al. (2001), memperlihatkan bahwa bakteri Pseudomonas stutzeri SU2 dapat mereduksi nitrat sebanyak 99,24% pada konsentrasi oksigen tinggi (92%). Sementara itu pada Thiosphaera pantotropha ATCC 35512 pada kondisi oksigen dan suhu yang sama hanya dapat mereduksi nitrat sebesar 27-29%. Implikasi penghambatan oksigen terhadap reduksi nitrat tidak selalu terjadi, pada bakteri Alcaligenes faecalis reduksi nitrat dapat berlangsung secara simultan dibawah kondisi aerobik (Otte et al. 1996). Reduksi nitrat pada kondisi aerob diduga lebih dominan dikatalisasi enzim nitrat reduktase diperiplasma, yang merupakan ekspresi gen Nap. Gen penyandi enzim Nap terekspresi pada kondisi aerob dan anaerob (Bedzyck et al. 1999). Enzim Nap karena terletak di periplasma tidak dipengaruhi transfor nitrat ke membran plasma. Nitrat diduga dapat masuk melalui membran luar (pada bakteri Gram negatif) melalui porin dengan perbedaan konsentrasi atau pertukaran muatan ion. Bakteri DNRA pada respirasi aerob memerlukan oksigen sebagai akseptor elektron. Seperti E. coli mensintesis dua kompleks sitokrom oksidase berbeda, yaitu sitokrom bo (jenis sitokrom b) dan sitokrom bd (jenis sitokrom d). Sitokrom bo merupakan sitokrom yang mampu memompa proton sehingga menghasilkan beda potensial Δρ, sedangkan sitokrom bd tidak mampu memompa proton. Ketika suasana anaerob terdapat elektron akseptor (nitrat dan fumarat) (Purwoko 2007). Bakteri DNRA mereduksi nitrat tinggi, membentuk nitrit dan amonium yang sedikit serta menghasilkan gas yang tinggi. Penggunaan bakteri ini sebagai pengendalian pencemaran diharapkan proses reduksi nitrat membentuk nitrit dan amonium sedikit serta menghasilkan produk samping bukan berupa gas N 2 O,
37 karena produksi N 2 O ini berdampak terhadap pemanasan global. N 2 O merupakan salah satu gas rumah kaca yang potensial (Rusmana 2003a). Begitu juga halnya dengan nitrit dan amonia, dalam konsentrasi yang tinggi akan bersifat toksik bagi organisme akuatik (Effendi 2003). Kondisi aerob reduksi nitrat banyak terjadi pada periplasma oleh enzim Nap yang berperan sebagai pengatur keseimbangan redoks pada posforilasi oksidatif membran. Isolat HF7 setelah inkubasi 36 jam masih mengalami kenaikan reduksi nitrat. Peristiwa ini diperkirakan bahwa aktivitas enzim Nar meningkat dengan habisnya oksigen pada medium. Kecepatan rata-rata reduksi nitrat pada sumber karbon asetat, suksinat, glukosa, dan gliserol oleh isolat LF6 tidak terlalu berbeda. Diperkirakan enzim Nap isolat LF6 lebih dominan. Enzim Nap tetap mereduksi nitrat pada saat konsentrasi nitrat rendah atau tinggi. Isolat LF6 mampu tumbuh pada konsentrasi nitrat rendah seperti pada isolasi awal. Isolat LF6 diisolasi dari sedimen muara sungai Cisadane dengan media pengkayaan nitrat 0,1 mm (Syahputra 2008). Hasil uji nitrit (NO - 2 ) pada tahap seleksi menunjukkan isolat FR1 mengakumulasi nitrit paling tinggi masa inkubasi 72 jam. Isolat FR1 memiliki gen nitrit reduktase terbatas, sehingga pengubahan nitrit menjadi amonium lambat. Isolat FR1 cenderung memanfaatkan lebih banyak nitrat sebagai akseptor elektron untuk menimbulkan energi dari pada menggunakan nitrit. Hal ini sesuai dengan perhitungan termodinamika perubahan nitrat menjadi nitrit menghasilkan energi lebih besar dari pada perubahan nitrit menjadi amonium (Rusmana 2003a). Persamaan reaksinya adalah sebagai berikut: NO - - 3 + H 2 NO 2 + H 2 O ( G = -163,03 KJ per mol H 2 ) NO - 2 + 3H 2 +2H + + NH 4 + 2 H 2 O ( G = -145,95 KJ per mol H 2 ) Akumulasi nitrit tertinggi pada isolat FR1 terjadi pada glukosa sebagai sumber karbon dengan kondisi anaerob sebanyak 0,14 mm, karena bakteri dengan memanfaatkan glukosa sebagai sumber energi sudah cukup untuk memenuhi kebutuhan energi oleh karena itu bakteri tidak mereduksi nitrit menjadi amonium sehingga nitrit terakumulasi. Faktor genetik dan faktor lingkungan juga mempengaruhi aktivitas reduksi nitrit. Aktivitas Nir B dan Nrf terbatas karena tidak tersedianya NADH dan format dalam jumlah banyak sehingga nitrit
38 terakumulasi. Sebab aktivitas Nir B dipengaruhi NADH (Harbone et al. 1992), sedangkan Nrf dipengaruhi format sebagai akseptor elektron (Cole 1996). Dari uji kinetika ternyata reduksi nitrat tercepat umumnya mulai jam ke 12 sampai jam ke 36 dengan inokulan yang sudah dalam fase eksponensial (24 jam). Penurunan konsentrasi nitrat yang tereduksi lebih terlihat berbanding lurus dengan peningkatan jumlah sel. Kerapatan sel tertinggi terjadi setelah jam ke 36 Hal ini dikarenakan nitrat digunakan sebagai akseptor elektron untuk menghasilkan energi. Sedangkan konsentrasi amonium yang terbentuk kecendrungan menjadi naik setelah jam ke 36, kerena dalam kondisi nitrat mulai berkurang maka nitrogen akan mendekat ke arah amonium. Hasil uji nitrit setiap selang waktu 12 jam menunjukkan isolat FR2 mengakumulasi nitrit pada jam ke 12 sampai jam ke 24 dan konsentrasinya menurun sejalan dengan peningkatan konsentrasi amonium. Pada isolat HF7 terjadi fluktuasi akumulasi senyawa nitrit, tetapi pada akhir inkubasi isolat HF7 mengakumulasi nitrit menurun. Akumulasi konsentrasi nitrit tertinggi terjadi setelah jam 36. Hal ini menunjukkan affinitas enzim Nir dan Nrf terhadap nitrit pada kedua isolat cukup baik. Samuelsson (1985) melaporkan bahwa level nitrit meningkat sejalan dengan menurunnya level nitrat pada media glukosa setelah 80 jam inkubasi dan amonium meningkat dalam medium dalam medium glukosa dan berkorelasi dengan reduksi nitrit menjadi nitrat. Fermentasi yang dilakukan bakteri DNRA dapat meningkatkan jumlah nitrit (Kelso et al. 1997). Terakumulasinya nitrit diperkirakan merupakan cara bakteri untuk bisa survival dilingkungan dengan tidak mereduksi nitrit menjadi amonium sehingga tidak terjadi penumpukan elektron dari transfer elektron hasil perubahan nitrit menjadi amonium tersebut. Disamping faktor suhu jumlah subtrat mempengaruhi reaksi enzimatik. Jumlah relatif subtrat berpengaruh pada posisi akhir reaksi dan produk pada kesetimbangan untuk mencapai kestabilan termodinamika. Laju reaksi enzimatik sangat dipengaruhi jumlah subtrat dan enzim. Umumnya jumlah subtrat tinggi (dalam batasan optimum) dan kemampuan enzim untuk menurunkan energi aktivasi meningkatkan laju reaksi enzimatik (Kuchel P dan Ralston GB 2006).
39 Hasil uji amonium (NH + 4 ) pada tahap seleksi memperlihatkan isolat FR2 dan HF7 menghasilkan amonium lebih tinggi dari isolat FR1 dan LF6. Daya afinitas enzim nitrit reduktase isolat FR2 dan HF7 terhadap subtrat nitrit lebih baik, sehingga reaksi enzimatik nitrit menjadi amonium dapat berlangsung lebih cepat. Isolat yang menghasilkan senyawa amonium tinggi dapat diestimasikan menghasilkan gas N 2 O lebih sedikit. Hasil penelitian menunjukkan konsentrasi nitrat tinggi menghasilkan estimasi gas N 2 O atau akumulasi senyawa antara yang belum terdeteksi lebih tinggi, dibandingkan konsentrasi nitrat rendah. Amonium yang dihasilkan pada uji kinetika aktivitas reduksi nitrat menunjukkan konsentrasi amonium meningkat sejalan dengan lamanya waktu inkubasi dan penurunan konsentrasi nitrit. Jumlah amonium dari isolat FR2 dan HF7 setelah diinkubasi selama 72 jam dengan sumber karbon asetat dan suksinat. Hal ini diduga sistem nitrat reduktase berjalan lebih sempurna. Enzim Nar terekspresi, sehingga perubahan nitrat menjadi nitrit tidak hanya dilakukan enzim Nap. Nitrit yang dihasilkan lebih banyak, dengan keberadaan enzim-enzim Nir dan Nrf secara cepat nitrit diubah menjadi amonium. Pada penelitian ini diduga konsentrasi nitrat medium yang tinggi (49,41mM) mempengaruhi mekanisma kerja enzim Nir dan Nrf dalam menghasilkan produk akhir amonium. Walaupun enzim Nir dan Nrf tetap mereduksi nitrit tetapi mempengaruhi hasil akhir pembentukan amonium. Pembentukan amonium persamaan reaksi sederhananya adalah sebagai berikut: NO - 2 + 3H 2 +2H + + NH 4 + 2 H 2 O Proses biokimia pembentukan amonium dalam reaksi enzimatik sel tidak seperti reaksi biasa diatas tetapi melalui tahapan beberapa senyawa. Faktor eksternal dan internal bakteri fermentatif mempengaruhi produk akhir amonium. Dalam penelitian ini diduga jumlah subtrat (nitrat) yang tinggi meningkatkan laju reaksi reduksi nitrat tapi tidak seluruhnya menghasilkan produk akhir senyawa amonium. Pada penelitian ini diduga produk samping dari pembentukan senyawa amonium lebih banyak. Dugaan lain adalah amonium yang dihasilkan tetap tinggi, tetapi dimanfaatkan untuk biosintesis sel pada saat sumber nitrogen untuk biosintesis terbatas sementara akseptor elektron, donor elektron, dan senyawa kebutuhan metabolisma lainnya masih tersedia.
40 Pengaruh perbedaan sumber karbon terhadap gas yang dihasilkan pada bakteri DNRA akan tergantung pada senyawa amonium yang dihasilkan dan senyawa nitrit yang diakumulasi. Proses poduksi gas ditentukan oleh kelengkapan enzim yang dimiliki bakteri DNRA serta kondisi lingkungan. Bakteri DNRA dapat menghasilkan amonium lebih tinggi dan gas lebih rendah jika memiliki enzim Nap, Nar, Nir dan Nrf. Faktor lingkungan seperti konsentrasi oksigen, ph, suhu, konsentrasi nitrat, senyawa organik, dan anorganik sebagai aktivator atau inhibitor mempengaruhi ekspresi dan optimalisasi kerja enzim. Kemungkinan adanya enzim lain selain Nap, Nar, Nir, dan Nrf. dari kedua isolat juga belum diketahui pasti.