III. BAHAN DAN METODE A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari hingga September 2014 di Laboratorium Kimia Fakultas MIPA untuk identifikasi senyawa ekstrak, Laboratorium Hama dan Penyakit Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta untuk in vitro, uji fitotoksisitas dan uji in planta bibit kubis dan analisis dampak lingkungan serta pengambilan inokulum P. brassicae di lahan petani kubis di desa Gondosuli, Kecamatan Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah. Bahan daun paitan diambil dari tanaman liar didekat kantor kecamatan Jebres. Analisis dampak lingkungan dilakukan di Laboratorium Hama dan Penyakit Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta. B. Bahan dan Alat Penelitian 1. Identifikasi Senyawa Aktif Ekstrak Daun Paitan Bahan utama yang digunakan dalam analisis senyawa aktif ekstrak daun paitan antara lain sampel ekstrak daun paitan, aquades petroleum ether, etyl acetate, n-hexane, plat Silica gel 60 F 254, khemikalia yang digunakan untuk uji thin layer chromatograph (TLC) golongan senyawa alkaloid, flavanoid dan saponin (Lampiran 4). Alat yang digunakan antara lain kertas saring, micro pipet, chamber, sprayer, beaker glass, tabung reaksi, pensil, penggaris, dan kamera digital. 2. Uji toksisitas in vitro Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah media biakan PDA (Potato Dextrose Agar), ekstrak daun paitan dan isolat Fusarium oxysporum f. sp. cepae (FOCe). Alat yang digunakan meliputi tabung reaksi, pipet, pipet ukur, gelas ukur, pinset, pisau, plastik wrap, autoklaf, laminar air flow, lampu bunsen, dan kamera digital. 3. Uji fitotoksisitas ekstrak pada bibit Bahan yang digunakan pada uji ini adalah ekstrak daun paitan, benih kubis (varietas F-1 Hybrid cabbage), polybag, tray semai dan media tanam (tanah, cocopeat, kompos). Alat yang digunakan yaitu sekop, gelas ukur, gembor dan mikro pipet. 4. Uji in planta Bahan utama yang digunakan dalam uji in planta bibit kubis antara lain benih kubis (varietas F-1 Hybrid cabbage), tanah, cocopeat, kompos, inokulum P. brassicae dan 12
13 ekstrak daun paitan. Alat yang digunakan antara lain timbangan analitik, pisau, mikroskop, blender, tray persemaian, polybag ukuran 5x5x8 (dengan volume 200cm 3 ), penggaris, gembor dan kamera digital. 5. Analisis populasi mikroba tanah Bahan utama yang digunakan dalam analisis dampak lingkungan adalah sampel tanah, media NA (Nutrient Agar), media PDA (Potato Dextrose Agar), media SCA (Starch Casein Agar), air steril dan alkohol. Alat yang digunakan antara lain petridish, tabung reaksi, lampu bunsen, autoklaf, spreader (perata), piper ukur, dan kamera digital. C. Perancangan Penelitian Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan rancangan penelitian yang disusun berdasarkan rancangan acak lengkap (RAL) dengan faktor pertama perlakuan perbedaan dosis.: K= pemberian air tanpa ekstrak sebagai pembanding 1 = ekstrak daun paitan 2 ml 2 = ekstrak daun paitan 5 ml 3 = ekstrak daun paitan 8 ml Faktor kedua yaitu jenis pelarut ekstraksi yang digunakan : PE= Petroleum ether EA= Etyl acetate NH= n-hexane. Sehingga penelitian ini terdiri atas 9 kombinasi perlakuan, setiap kombinasi terdapat 3 unit pengamatan dan diulang sebanyak 3 kali, sebagai pembanding lainnya terdapat kontrol (tanpa pemupukan). Perancangan penelitian digunakan pada uji in planta yang sebelumnya dilakukan uji in vitro dan fitotoksik yang digunakan sebagai acuan penggunaan ekstrak daun paitan. D. Pelaksanaan Penelitian 1. Analisis senyawa aktif a. Penyediaan ekstrak daun T. diversifolia T. diversifolia diperoleh dari daerah sekitar Universitas Sebelas Maret Surakarta. Bahan yang digunakan yaitu daun paitan segar yang dicacah halus kemudian dimasukkan ke bekerglass untuk dilakukan ekstraksi. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi
14 perbandingan 1:1 yaitu 500 gram cacahan daun paitan dan 500 ml pelarut yang disimpan pada suhu ruangan selama 48 jam tanpa terkena cahaya. Larutan yang diperoleh kemudian disaring menggunakan kertas saring. Larutan yang telah disaring dimasukkan dalam rotary evaporator untuk menghilangkan kandungan pelarutnya sehingga ekstrak daun paitan bisa disimpan untuk selanjutnya diuji kandungannya. Terdapat 3 jenis pelarut yang digunakan yaitu n-hexane, etyl acetate, dan petroleum ether. b. b. Uji thin layer chromatograph (TLC) Analisis golongan senyawa aktif ekstrak daun paitan dilakukan pada masing-masing jenis ekstrak dengan mengidentifikasi tiga jenis golongan senyawa aktif, yaitu : golongan senyawa alkaloid, flavanoid dan saponin. Identifikasi senyawa aktif menggunakan uji thin layer chromatograph (TLC) pada masing-masing ekstrak. Uji TLC digunakan untuk mengidentifikasi keberadaan golongan senyawa tertentu yang dilihat berdasarkan dari nilai Ratio flow (Rf) pada plat TLC (Lampiran 4). 2. Uji toksisitas in vitro Penelitian ini dilakukan dengan jamur indikator Fusarium oxysporum f.sp. cepae. Pengujian dilakukan pada media PDA untuk kultur ganda antara Fusarium oxysporum f.sp. cepae dengan ektrak daun paitan. Unit percobaan disusun dengan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). pemberian PE= petroleum ether, ET= etyl acetat, HN= n-hexane dengan faktor perlakuan pemberian konsentrasi ekstrak masing-masing 10%, 20%, 30%, 40% dan 50%. Konsentrasi yang diujikan bertujuan untuk mengetahui hambatan maksimum ekstrak daun paitan terhadap F. oxysporum f. sp. cepae. Terdapat perlakuan pemberian pelarut tanpa ekstrak dan pemberian aquades sebagai kontrol. Jamur indikator ditumbuhkan pada medium tersebut kemudian dihitung pertumbuhan koloni. Pengamatan diameter (zona hambatan) dilakukan 3 hari sekali sampai 9 hari setelah isolasi yang hasilnya dianalisis regresi. 3. Uji fitotoksisitas Pengujian dilakukan dengan menyiramkan 2 ml larutan ekstrak pada bibit tanaman kubis masing-masing pada konsentrasi 0%;0,2%; 0,5%; dan 1,0%. Aplikasi dilakukan setiap minggu selama empat minggu. Gejala fitotoksik pada
tanaman yang muncul diamati setiap minggu. Uji fitotoksik digunakan sebagai acuan konsentrasi ekstrak daun paitan yang aman bagi tanaman. 15 4. Uji in planta bibit kubis a. Persemaian dan persiapan media tanam Benih kubis disemaikan pada media campuran cocopeat dan kompos (1:1). Benih disemaikan selama seminggu dan siap dipindah tanam untuk pembibitan pada media campuran tanah dan kompos (1:1) dalam nampan berukuran 30x20x10cm. Masingmasing berisi 5 kg media tanam. b. Penyediaan inokulum P. brassicae dan inokulasi patogen Inokulum P. brassicae berasal dari akar kubis yang terinfeksi pada lahan petani di desa Gondosuli, Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah. Akar kubis yang terinfeksi akar gada dicuci bersih dengan air mengalir kemudian dibilas menggunakan air steril. Akar yang telah bersih dipotong-potong dan ditambahkan aquades kemudian diblender lalu disaring menggunakan kain kasa. Suspensi yang diperoleh dihitung kerapatan sporanya hingga 10 5 dan dicampurkan dengan media tanam yang telah disiapkan. Volume inokulum yang dicampur pada media tanam adalah 10 5 spora g -1 media tanam. c. Penanaman dan aplikasi ekstrak Pemberian ekstrak dilakukan sesuai perlakuan seminggu sebelum bibit pindah tanam. Pemindahan bibit sejumlah 90 bibit dilakukan setelah kubis disemaikan selama 7 hari, dipindahkan pada media tanam yang telah diinokulasi dengan patogen akar gada dalam polybag. Ekstrak yang diberikan dicampur dengan air sesuai konsentrasi ekstrak yang diuji fitotoksisitasnya, kemudian disiramkan pada media tanam sesuai dosis perlakuan. d. Pemeliharaan dan panen Pemeliharaan yang dilakukan adalah penyiraman. Penyiraman dilakukan 3 kali seminggu hingga bibit kubis dipanen pada umur 90 HST. 5. Analisis populasi mikroba tanah Analisis dilakukan untuk mengamati populasi mikrob dalam media pembibitan. Pengamatan mikrob secara umum menggunakan media NA, PDA dan SCA. Analisis dampak lingkungan dilakukan setelah bibit kubis dipanen. Teknik identifikasi populasi mikrob dilakukan dengan metode tidak langsung, yaitu berdasarkan jumlah koloni pada
16 media. Prosedur mengidentifikasi mikrob dilakukan dengan menimbang contoh tanah dari masing-masing perlakuan sebanyak 1 g kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah terisi 9 ml air steril lalu dihomogenkan selama 5 menit. Suspensi diambil 1 ml dan ditambahkan 9 ml air steril (pengenceran 10-2 ) lalu dikocok hati-hati sampai homogen. Pengenceran dilakukan hingga pengenceran 10-4 selanjutnya inokulasi secara aseptik dilakukan dalam LAF dengan mengambil 0,1 ml suspensi dari masingmasing pengenceran 10-4 dan diulang sebanyak tiga kali, kemudian dituangkan ke dalam petridish yang telah terisi media lalu diratakan ke seluruh permukaan media. Petridish kemudian diberi plastik wrap dan diberi label sesuai dengan perlakuan dan tingkat pengenceran, setelah itu dilakukan inkubasi. E. Pengamatan Peubah 1. Analisis sifat kimia ekstrak Senyawa yang diidentifikasi pada ekstrak yaitu golongan alkaloid, flavanoid dan saponnin. Perhitungan dilakukan dengan menghitung nilai Rf (ratio flow) yang ditunjukkan TLC. Rf= Rf= ratio of flow, dc= jarak berjalan oleh molekul komponen dari titik awal, ds= jarak berjalan oleh pelarut dari titik awal (Mazuduzaman et al. 2008). 2. Uji toksisitas in vitro Pengamatan diameter (zona hambatan) selama 1-2 minggu. Persentase hambatan diukur dengan menggunakan rumus sebaai berikut : Keterangan : r1 = jari-jari koloni Fusarium menjauhi ekstrak r2 = jari-jari koloni Fusarium mendekati ekstrak 3. Uji fitotoksisitas Pengamatan gejala fitotoksis ekstrak dilakukan selama seminggu sekali dengan melihat kondisi tanaman yang mengalami perubahan setelah diberi perlakuan ekstrak. Pengamatan yang dilakukan adalah tanaman hidup dan tanaman mati
17 4. Uji in planta bibit kubis a. Tinggi bibit kubis Pengamatan tinggi bibit dilakukan setiap 3 hari sekali hingga bibit berumur 102 HST. Tinggi bibit diukur secara manual menggunakan penggaris dari permukaan media hingga titik tumbuhnya. b. Intensitas penyakit Pengamatan intensitas penyakit akar gada dilakukan setelah bibit dipanen dengan metode skoring (Baharuddin et al. 2002) dengan rumus berikut: ( ) n = jumlah tanaman yang diamati menunjukkan skor tertentu v = skor untuk tanaman tertentu N= skor tertinggi Z = jumlah seluruh tanaman yang diamati Penilaian skoring 0 3, 0 = tidak terdapat gejala pembengkakan, 1 = terdapat gejala pembengkakan pada akar utama, 2 = terdapat gejala pembengkakan pada akar sekunder dan 3 = terdapat gejala pembengkakan pada akar utama maupun sekunder c. Jumlah daun bibit kubis Pengamatan jumlah daun bibit dilakukan setiap 3 hari sekali dari umur 12 hari hingga bibit berumur 36 hari setelah semai. 5. Analisis populasi mikroba tanah Pengamatan dilakukan pada hari ketiga dan ketujuh untuk bakteri dan jamur dan hari ke empat belas untuk Actinomycetes lalu dicatat jumlah koloni yang tumbuh dengan menggunakan hand colony counter kemudian dihitung populasi per gram tanah dengan menggunakan rumus: Colony Forming Units (CFU) g -1 tanah = ( )
18 F. Analisis Data Data hasil pengamatan dianalisis menggunakan analisis ragam berdasarkan uji F taraf 5% untuk mengetahui pengaruh perlakuan terhadap berbagai variabel yang diamati. Uji Jarak Berganda Duncan dilakukan apabila terdapat pengaruh nyata perlakuan terhadap variabel pengamatan.