3 METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2012 hingga Juli 2012. Penelitian ini diawali dengan pengambilan sampel yang dilakukan di persawahan daerah Cilegon, Banten. Tahap berikutnya yaitu preparasi sampel yang dilakukan di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan IPB. Analisis sampel yang meliputi berbagai uji dilakukan di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan dan Mikrobiologi Hasil Perairan Teknologi Hasil Perairan Institut Pertanian Bogor. 3.2 Alat dan Bahan Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah tumbuhan semanggi air (M. crenata). Pelarut yang digunakan adalah pelarut pro analisis berupa heksana (nonpolar), etil asetat (semi polar), dan metanol (polar). Bahan lain yang digunakan antara lain alumunium foil, kertas saring Whatman 42, alkohol, akuades, kertas cakram (paper disc) Whatman, media Nutrient agar (NA), Nutrient Broth (NB), Mueller Hinton Agar (MHA), serta antibiotik kloramfenikol, biakan bakteri Bacillus subtilis dan Escherichia coli. Alat yang digunakan seperti timbangan digital (AND HF-400), gelas piala, gelas ukur, botol vial, labu ukur, corong, labu Erlenmeyer, automatic shaker, mikropipet, tip mikro, cawan petri, tabung reaksi, pipet volumetrik, vortex (Velp Scientifica), kompor listrik, water shaker bath, pinset, laminar (Thermo 1300 seri A2), pipet tetes, incubator (Thermolyne type 42000), dan jangka sorong. 3.3 Metode penelitian Penelitian ini terdiri dari empat tahap, yaitu tahap pengambilan dan preparasi sampel, ekstraksi komponen bioaktif, uji fitokimia, dan analisis aktivitas antibakteri. Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 9.
18 Sampel daun semanggi air Pencacahan Pengeringan udarakan sampel daun selama 17 jam Sampel daun kering udara Penambahan heksana (1:5) (b/v) Maserasi selama 24 jam hingga bening Penyaringan dengan kertas Whatman 42 Residu Filtrat Penambahan etil asetat (1:5) (b/v) Maserasi selama 24 jam hingga bening Penyaringan dengan kertas Whatman 42 Residu Filtrat Penambahan metanol (1:5) (b/v) Maserasi selama 24 jam hingga bening Penyaringan dengan kertas Whatman 42 Residu Filtrat Evaporasi Gambar 9 Diagram alir penelitian.
19 Ekstrak kasar heksana Ekstrak kasar etil asetat Ekstrak kasar metanol Analisis: Rendemen Uji fitokimia (Harborne 1987) Uji aktivitas antibakteri Gambar 9 Diagram alir penelitian (lanjutan). 3.3.1 Pengambilan dan preparasi sampel Marsilea crenata merupakan tanaman air yang tumbuh liar di daerah sekitar persawahan. Semanggi air ini diambil bagian daunnya. Preparasi M. crenata ini pertama dicuci dengan air mengalir, kemudian daunnya dihaluskan dengan cara pencacahan. Daun yang telah dihaluskan kemudian dikeringudarakan selama 17 jam. Daun yang sudah kering ditimbang sebanyak 20 gram. 3.3.2 Ekstraksi komponen bioaktif (Andayani 2008) Ekstraksi bahan aktif dilakukan dengan mengacu pada penelitian Andayani (2008) yang dimodifikasi. Proses ini menggunakan tiga jenis pelarut (ekstraksi bertingkat) yaitu heksana (nonpolar), etil asetat (semipolar), dan metanol (polar). Semanggi air yang telah dikeringkan dan dihaluskan kemudian ditimbang sebanyak 20 gram lalu dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan ditambahkan 100 ml pelarut (1:5). Sampel dimaserasi selama 24 jam menggunakan automatic shaker pada suhu kamar. Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman 42 sehingga diperoleh filtrat dan residu. Residu sampel dimaserasi kembali dengan pelarut yang sama hingga bening atau sama dengan warna pelarut awal, kemudian diganti dengan pelarut lain secara bertingkat (nonpolar, semipolar dan polar). Proses maserasi yang dilakukan diawali dari pelarut heksana, etil asetat, dan metanol. Filtrat yang diperoleh kemudian dikeringkan dengan vacuum rotary evaporator pada suhu 40 C hingga diperoleh ekstrak kasar berupa pasta.
20 3.3.3 Uji fitokimia (Harborne 1987) Uji fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid, steroid/triterpenoid, flavonoid, saponin, dan fenol hidrokuinon. Uji ini dilakukan untuk mengetahui keberadaan komponen bioaktif yang terdapat pada M. crenata. 1) Alkaloid Uji alkaloid dilakukan dengan melarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid, yaitu pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji positif diperoleh bila terbentuk endapan putih kekuningan dengan pereaksi Meyer, endapan coklat dengan pereaksi Wagner atau endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff sehingga jika pengujian terhadap salah satu pereaksi positif, maka dalam tumbuhan uji tersebut terdeteksi alkaloid. Pereaksi Meyer dibuat dengan menambahkan 1,36 HgCl 2 dengan 0,5 g KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml dengan labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi Wagner berwarna coklat dibuat dengan cara 10 ml akuades dipipet kemudian ditambahkan 2,5 gram iodin dan 2 gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 ml dalam labu takar. Pereaksi Dragendorff berwarna jingga dibuat dengan cara 0,8 g bismut subnitrat ditambahkan dengan 10 ml asam asetat dan 40 ml air. Larutan ini dicampur dengan larutan yang dibuat dari 8 gram KI dalam 20 ml air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume campuran 20 ml asam asetat glasial dan 100 ml air. 2) Triterpenoid/steroid Sejumlah sampel dilarutkan dalam 2 ml kloroform dalam tabung reaksi yang kering lalu ditambahkan 10 tetes anhidra asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya larutan berwarna merah untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau. 3) Saponin (uji busa) Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin.
21 4) Fenol Hidrokuinon Sebanyak 1 gram sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl 3 5%. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau atau hijau biru. 5) Flavonoid Sebanyak 0,5 mg sampel ditambahkan serbuk magnesium 0,1 mg dan 0,4 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol. 6) Tanin Sebanyak 0,5 mg sampel ditambahkan FeCl 3 kemudian campuran dihomogenkan. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna merah pada campuran. 7) Uji Molisch Larutan sampel sebanyak 1 ml diberi 2 tetes pereaksi Molisch dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Uji positif yang menunjukkan adanya karbohidrat ditandai dengan terbentuknya kompleks warna ungu diantara 2 lapisan cairan. 8) Benedict Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan ke dalam 5 ml pereaksi Benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Hasil uji positif sampel mengandung gula pereduksi yaitu terbentuknya larutan berwarna hijau kuning atau endapan merah bata. 9) Biuret Larutan sampel sebanyak 1 ml ditambahkan pereaksi biuret sebanyak 4 ml. Campuran kemudian dikocok dengan seksama. Hasil uji senyawa peptida dengan terbentuknya larutan berwarna ungu. 3.3.4 Analisis aktivitas antibakteri Pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak kasar daun semanggi air melalui beberapa tahap, yaitu persiapan bakteri melalui peremajaan bakteri dan
22 kultivasi bakteri uji. Kondisi kultur bakteri yang telah disiapkan sebagai bakteri uji kemudian dilakukan pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi kertas cakram (paper disc). Peremajaan bakteri uji Media yang digunakan adalah NA dengan komposisi: ekstrak daging 1%, pepton 1%, dan agar 1,5%. Media dilarutkan dalam akuades dan dipanaskan hingga larut sempurna, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 4 ml dan disterilkan dalam otoklaf pada suhu 121 C, tekanan 1 atm selama 15 menit. Setelah steril, tabung dimiringkan dan didiamkan hingga memadat. Sebanyak 1 ose stok bakteri (B. subtilis dan E. coli) diinokulasi ke dalam media regenerasi kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam. Kultivasi bakteri uji Bakteri (Bacillus subtilis dan E. coli) yang segar diinokulasikan sebanyak 1 ose ke dalam media NB, diinkubasi semalam pada suhu 37 C dengan kecepatan putaran 150 rpm selama 18-24 jam. Kultur bakteri diukur kekeruhannya secara turbidimetri menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 600 nm hingga mencapai OD sebesar 0,6. Pengujian aktivitas senyawa antibakteri ekstrak kasar semanggi air terhadap bakteri uji (Modifikasi Murray et al. 1995) Pengujian dilakukan dengan metode cakram kertas (paper disc). Sampel antibakteri merupakan senyawa aktif hasil proses ekstraksi semanggi air. Proses pengujiannya adalah sebagai berikut: bakteri (B. subtillis dan E. coli) yang telah diinokulasi ke dalam media pertumbuhan NB, masing-masing dimasukkan ke dalam media MHA steril. Media MHA yang mengandung bakteri uji dihomogenisasi menggunakan vortex kemudian dituang pada cawan petri steril secara aseptis. Konsentrasi ekstrak kasar yang dimasukkan ke dalam cakram kertas (paper disc), yaitu 2 mg, 1 mg, dan 0,5 mg, serta kontrol positif dan negatif. Perlakuan kontrol positif yaitu menggunakan antibiotik kloramfenikol dengan konsentrasi 10 mg/ml. Kontrol negatif menggunakan pelarut dalam proses ekstraksi yaitu heksana, etil asetat, dan metanol. Kertas cakram kemudian diletakkan diatas lapisan MHA di dalam cawan petri yang telah mengeras. Cawan petri diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam dan dilakukan pengukuran aktivitas antibakteri yang ditentukan dengan mengukur
23 zona hambatan (dalam milimeter) yang terbentuk di sekeliling kertas cakram dikurangi dengan diameter kertas cakram (6 mm).