BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian yang dilakukan ini bersifat eksperimental karena pada penelitian ini dilakukan dengan memanipulasi objek penelitian disertai dengan adanya kontrol. Objek penelitiannya berupa pertumbuhan jamur pada medium Potato Sucrose Agar (PSA) yang ditambah dengan ekstrak rimpang kunyit yang telah disimpan pada berbagai lama dan suhu penyimpanan. Kontrol penelitian berupa pertumbuhan jamur pada medium kontrol (PSA ditambah akuades, PSA ditambah DMSO 1%, dan PSA ditambah Dithane-M 45 0,2%). Pada penelitian ini terdapat variabel penelitian berupa variabel bebas yaitu lama dan suhu penyimpanan ekstrak rimpang kunyit pada medium PSA, variabel terikat yaitu diameter pertumbuhan (mm) dan persentase penghambatan (%) miselia jamur, dan variabel kendali yaitu umur jamur (8 hari jamur C. gloeosporiodes Penz.) dan macam medium (PSA). B. Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2009 sampai dengan Juli 2009 di laboratorium Mikrobiologi dan Genetika Jurusan Pendidikan Biologi, Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Indonesia. Penelitian yang dilakukan meliputi uji hayati berbagai lama 21
22 dan suhu penyimpanan ekstrak rimpang C. domestica Val. terhadap pertumbuhan jamur C. gloeosporioides Penz. secara in vitro. C. Desain Penelitian Rancangan yang digunakan adalah faktorial 2x8 dalam Rancangan Kelompok Teracak Sempurna (RKLT) (Kristianti et al., 2007). Jumlah perlakuan yang digunakan adalah delapan perlakuan dengan menggunakan lama dan suhu penyimpanan ekstrak yang berbeda dan kontrol menggunakan Akuades, Dimetil Sulfoksida (DMSO) 1% dan Dithane-M 45 0,2% (Harish, et al., 2004:367). Konsentrasi ekstrak rimpang kunyit yang digunakan adalah 0,04% sesuai dengan hasil uji terdahulu (Adhimah, 2008:51). Terdapat dua faktor yang dianalisis faktor pertama adalah lama penyimpanan ekstrak rimpang kunyit 0 hari (L 0 ), 7 hari (L 1 ), 14 hari (L 2 ), 21 hari (L 3 ), 28 hari (L 4 ) dan 35 hari (L 5 ). Faktor kedua adalah suhu penyimpanan suhu kamar 24±2 C (S 1 ) dan suhu dingin 10±2 o C (S 2 ). Untuk kontrol akuades (A) dan DMSO 1% sebagai kontrol negatif (K-) dan kontrol Dithane-M 45 0,2% sebagai kontrol positif (K+). Jumlah banyaknya perlakuan untuk setiap pengulangan diperoleh berdasarkan rumus pengulangan RKLT (Gomez,1995:94) dengan rumus : (t) (r) - 1 20, dimana t adalah perlakuan dan r adalah banyaknya replikasi. Jadi : (t) (r) - 1 20 (8) (r) - 1 20 8r -1 20
23 8r 21, jadi r 3 Berdasarkan perhitungan di atas, maka banyaknya pengulangan yang harus dilakukan paling sedikit tiga kali. Untuk mendapatkan data yang lebih akurat maka dilakukan pengulangan sebanyak empat kali. Jika L adalah lama penyimpanan ekstrak rimpang kunyit dan S adalah suhu penyimpanan ekstrak rimpang kunyit maka pengulangannya Ln dan Sn dimana n menunjukkan urutan pengulangan. A adalah akuades, K+ adalah kontrol positif dan K- adalah kontrol negatif. Jumlah kelompok percobaan atau plot disusun secara acak dari 1-72, dengan empat kali pengulangan sebagai berikut : Tabel 3.1. Desain Rancangan Kelompok Teracak Sempurna K+ A K+ L 3 S I K- L 4 S 2 L 1 S 1 K+ A L 4 S I L 2 S 2 L 2 S 1 L 3 S 2 K- L 5 S 2 L 0 S 2 L 5 S I L 1 S 2 L 1 S 1 L 3 S 2 K- L 0 S 1 L 3 S 1 A L 2 S 2 K- L 1 S 2 K+ A L 5 S 2 L 4 S 2 L 5 S 1 L 2 S 1 L 0 S 2 K+ L 4 S 1 L 2 S 2 A K+ L 5 S 1 L 3 S 1 L 1 S 2 L 0 S 1 L 4 S 1 L 5 S 2 L 3 S 2 A K- L 0 S 2 K+ L 1 S 1 K- L 2 S 1 L 4 S 2 L 4 S 2 L 3 S 1 K+ L 2 S 2 A L 0 S 1 A L 5 S 2 L 2 S 1 L 3 S 1 L 1 S 2 K- L 1 S 1 K- K+ L 5 S 1 L 3 S 2 L 0 S 2 Keterangan : L 0 S 1 : lama penyimpanan ekstrak 0 hari pada suhu ruang 24±2 C L 1 S 1 : lama penyimpanan ekstrak 7 hari pada suhu ruang 24±2 C
24 L 2 S 1 : lama penyimpanan ekstrak 14 hari pada suhu ruang 24±2 C L 3 S : lama penyimpanan ekstrak 21 hari pada suhu ruang 24±2 C L 4 S I : lama penyimpanan ekstrak 28 hari pada suhu ruang 24±2 C L 5 S 1 : lama penyimpanan ekstrak 35 hari pada suhu ruang 24±2 C L 0 S 2 : lama penyimpanan ekstrak 0 hari pada suhu 10±2 C (Konsentrasi ekstrak 0,04%) L 1 S 2 : lama penyimpanan ekstrak 7 hari pada suhu 10±2 C (Konsentrasi ekstrak 0,04%) L 2 S 2 : lama penyimpanan ekstrak 14 hari pada suhu 10±2 C L 3 S 2 : lama penyimpanan ekstrak 21 hari pada suhu 10±2 C L 4 S 2 : lama penyimpanan ekstrak 28 hari pada suhu 10±2 C L 5 S 2 : lama penyimpanan ekstrak 35 hari pada suhu 10±2 C A : Akuades K+ : Dithane-M 45 0,2% K- : DMSO 1%
25 D. Populasi dan Sampel Populasi dan sampel yang digunakan dalam penelitian ini yaitu : 1. Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah jamur C. gloeosporioides Penz. yang ditumbuhkan dalam medium PSA pada cawan Petri. 2. Sampel dalam penelitian ini diambil dari isolasi biakan jamur C. gloeosporioides Penz. yang diberi perlakuan dengan ekstrak rimpang kunyit (C. domestica Val.) pada lama dan suhu penyimpanan yang berbeda. E. Alat dan Bahan Alat-alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 3.2 dan 3.3 di bawah ini : Tabel 3.2. Alat yang Digunakan dalam Penelitian No Nama Alat Jumlah Spesifikasi 1 Alumunium foil 1 pak 25 sq.ft (7,6 m x 30 cm) 2 Autoklaf 1 buah Merek EYELE model HL36AE 4 Beaker glass 2 buah Gelas Pyrex ukuran 1 liter 5 Blender 1 buah Merek national 6 Botol pial 4 buah Kapasitas 50 ml 7 Cawan Petri 44 buah Gelas Pyrex, 95 mm 8 Gelas Ukur 2 buah Pyrex kapasitas 10 ml 9 Gelas objek dan gelas penutup 2 buah 25,4 x 76,2 mm (1 1 x 3 1 ) dan 1 mm - 1,2 mm 10 Inkubator 1 buah Suhu 25 C 12 Kain kasa secukupnya Steril 13 Kapas secukupnya Kapas pembalut 14 Kertas saring secukupnya Whatman no 1 15 Labu erlenmeyer 3 buah Pyrex kapasitas 500 ml
26 16 Lampu spirtus 2 buah Kapasitas 200 ml 17 Magnetik stirer 1 buah Model RCH-3 18 Mikropipet 1 buah Kapasitas 1 ml 19 Mikroskop 1 buah 1000 x perbesaran 20 Neraca digital 1 unit Merek AND ketelitian 0,001 mg 21 Oven 1 unit Termotec oven model SPF-300 22 Pisau 1 buah Tajam 23 Penggaris 1 buah Panjang 30 cm 24 Pelubang gabus 1 buah 6 mm 25 Rak tabung 4 buah Berbahan kayu 26 Tabung reaksi 50 buah Gelas Pyrex 27 Waterbath shaker 1 unit 50 cm x 30 cm, suhu 70 C Tabel 3.3. Bahan yang Digunakan dalam Penelitian No Nama Bahan Jumlah Spesifikasi 1 Agar-agar 15 gram Teknis 2 Akuades steril 1000 ml Disterilkan dengan autoklaf 3 Alkohol Secukupnya Konsentrasi 70% 4 DMSO 100 ml Konsentrasi 100% 5 Etanol 1000 ml Konsentrasi 96% 6 Kunyit 6 kg Petani di Padalarang 7 Kentang 200 gram Pasar lokal 8 Jamur C. gloeosporioides Penz. 1 stok kultur Koleksi BALITSA, Lembang 9 Sukrosa 100 gram Teknis
27 F. Prosedur Kerja 1. Tahap Persiapan a. Pembuatan Medium PSA Medium yang digunakan untuk pertumbuhan jamur C. gloeosporioides Penz. adalah medium Potato Sucrose Agar (PSA). Medium PSA merupakan salah satu medium yang dapat digunakan untuk menumbuhkan jamur (Gandjar,1999:134; Sangeetha dan Rawal, 2008:179). Cara membuat medium PSA adalah sebagai berikut: 200 gram kentang dipotong kecil-kecil kemudian direbus dalam 1000 mililiter akuades, setelah kentang empuk kemudian disaring kertas saring Whatman No.93 sehingga didapat ekstrak kentang. Ekstrak kentang kemudian dilarutkan dalam akuades sampai volumenya mencapai 1000 mililiter. Lima belas gram agar-agar dan 20 gram sukrosa dimasukkan ke dalam gelas kimia kemudian ditambahkan dengan 1000 mililiter ekstrak kentang, selanjutnya diaduk dan dipanaskan sampai mendidih selama 20 menit dengan menggunakan magnetic stirer with hot plate agar medium homogen. Setelah mendidih medium diangkat dan diukur ph-nya menggunakan ph meter kemudian diatur dengan menambahkan HCL 1 M dan NaOH 1 M sampai diperoleh ph 5,6. Medium yang sudah diukur kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sembilan mililiter. Kemudian disterilkan dalam autoclave pada suhu 121 C selama 15 menit, disimpan dalam lemari es sampai akan digunakan (Nurhayati, 2008:28).
28 b. Sterilisasi Semua alat gelas tahan panas, bahan, dan media yang tidak akan rusak jika terkena panas disterilkan dengan autoclave. Sterilisasi dengan autoclave menggunakan uap air bertekanan tinggi pada suhu 121 C selama 15 menit. Alat-alat yang tidak tahan panas disterilkan dengan alkohol. c. Identifikasi Jamur C. gloeosporioides Penz Identifikasi jamur C. gloeosporioides Penz. menggunakan metode slide kultur secara aseptik. Cawan Petri untuk slide culture steril (yang berisi kain kasa, sumpit kayu yang dibentuk segitiga, satu buah kaca objek dan dua buah kaca penutup) disiapkan medium PSA 5 ml dituangkan ke dalam cawan Petri dibiarkan membeku, dibuat kotak dengan ukuran 3 x 3 mm dan disimpan di atas kaca objek. Setelah itu, jamur C. gloeosporioides Penz. ditanamkan di atas kotak agar, menggunakan lup inokulasi dan ditutup dengan kaca penutup. Jamur ditumbuhkan selama delapan hari untuk jamur C. gloeosporioides Penz. dengan kondisi lembab, kemudian diamati bentuknya di bawah mikroskop dan diidentifikasi berdasarkan kunci determinasi (Heritage et al., 1996:145). d. Pemeliharaan dan Perbanyakan Jamur C. gloeosporioides Penz Jamur yang berasal dari kultur awal ditumbuhkan dalam medium PSA pada cawan Petri steril selama delapan hari untuk jamur C. gloeosporioides Penz. (Adhimah, 2008:34) pada suhu 24-26 C. Selanjutnya kultur siap untuk digunakan pada medium aktivasi.
29 e. Identifikasi Rimpang Kunyit (C. domestica Val.) Sebelum dilakukan ekstraksi terlebih dahulu dilakukan identifikasi rimpang kunyit. Rimpang kunyit diamati morfologi dan warnanya. f. Pembuatan Ekstrak Rimpang Kunyit (C. domestica Val.) Rimpang kunyit yang digunakan sebagai simplisia adalah rimpang induk C. domestica Val. yang relatif sama. Rimpang kunyit yang akan digunakan sebagai simplisia dibersihkan dengan mencucinya menggunakan air keran hingga bersih, kemudian dikeringkan pada tempat yang tidak terkena sinar matahari langsung, dikeringkan dengan cara diangin-anginkan supaya terdapat sirkulasi udara yang baik. Pengeringan ini bertujuan untuk memperoleh bahan tumbuhan yang tidak mudah rusak. Proses pengeringan selesai apabila rimpang telah kering. Kemudian setelah kering rimpang dihancurkan dengan menggunakan (Blender) sehingga diperoleh serbuk yang siap untuk diekstraksi. Serbuk rimpang kunyit kemudian dimaserasi (direndam) dengan etanol 95% dengan perbandingan 200 g/1000 ml (Balbi-Pena et al., 2006:311) kemudian diaduk dan dishaker minimal 24 jam. Simplisia yang telah diredam selanjutnya disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman no.1. Ekstrak etanol rimpang kunyit selanjutnya dievaporasi dengan menggunakan rotary evaporator (Lampiran B Gambar 2.1) pada suhu 50 C. Kemudian diuapkan dengan waterbath untuk menguapkan sisa pelarut etanol. Ekstrak yang sudah diuapkan pelarutnya,
30 kemudian disimpan pada botol gelap ditutup (Hashemi et al., 2008:1073; Yulia et al., 2006:253). g. Penentuan Lama Penyimpanan Ekstrak Rimpang Kunyit (C. domestica Val.) Ekstrak yang telah diperoleh dari proses ekstraksi disimpan selama yang telah ditentukan yaitu 0, 7, 14, 21, 28 dan 35 hari. Ekstrak yang telah diperoleh disimpan dibotol kecil tertutup dan berwarna gelap dan disimpan di suhu kamar (24±2 C) dan suhu dingin (10±2 o C). Masing-masing ekstrak yang disimpan pada suhu kamar (24±2 C) dan suhu dingin (10±2 o C) untuk setiap interval lama penyimpanan tertentu dicoba aktivitas antifunginya (Modifikasi metode Ungphaiboon et al., 2005:572). Lama penyimpanan 0 hari dilakukan dengan cara ekstrak yang disimpan pada suhu kamar (24±2 C) maupun suhu dingin (10±2 o C) didiamkan selama 6 jam sebelum digunakan untuk uji hayati. Setelah tujuh hari uji hayati ekstrak rimpang kunyit 0 hari maka dilakukan uji hayati untuk ekstrak rimpang kunyit 7 hari dan begitu seterusnya hingga ekstrak rimpang kunyit 35 hari. 2. Tahap Pelaksanaan a. Uji Hayati Untuk mengetahui lama dan suhu penyimpanan ekstrak rimpang kunyit yang efektif menghambat pertumbuhan jamur C. gloeosporioides Penz. maka dilakukan uji hayati. Masing-masing ekstrak rimpang kunyit disimpan
31 selama 0, 7, 14, 21, 28 dan 35 hari dan suhu kamar (24±2 C) dan suhu dingin (10±2 o C) pada konsentrasi ekstrak kunyit 0,04%. Untuk kontrol dilakukan dengan menggunakan akuades dan larutan DMSO 1% sebagai kontrol negatif dan Dithane-M 45 0,2% sebagai kontrol positif. Konsentrasi ekstrak dilakukan dengan cara pengenceran dengan melarutkan 1 ml ekstrak 0,4% dengan 9 ml PSA cair ke dalam cawan Petri, selanjutnya cawan Petri digoyang-goyangkan membentuk angka delapan agar medium dan ekstrak homogen. Setelah medium membeku diinokulasi dengan potongan miselium jamur C. gloeosporioides Penz. beserta agarnya dengan menggunakan pelubang gabus diameter 6 mm (Noveriza dan Tombe, 2003:31) dan diinkubasi sampai ± 7 hari dan diamati setiap harinya (Harish et al., 2004:366). Untuk mengetahui aktivitas daya hambat ekstrak rimpang kunyit terhadap pertumbuhan miselium jamur, maka diukur diameter pertumbuhan miseliumnya setelah diinkubasi selama ± 7 hari pada suhu kamar (24±2 C) (Cole et al., 2005:17; Soytong et al., 2005:35). b. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Rimpang Kunyit (C. domestica Val.) Ekstrak yang diperoleh dari proses ekstraksi kemudian dilarutkan dengan pelarut DMSO 1% untuk memperoleh konsentrasi ekstrak yang dikehendaki dalam perlakuan. Larutan yang telah diperoleh disimpan dalam botol kecil bertutup dan berwarna gelap. Konsentrasi ekstrak yang digunakan 0,04% untuk uji hayati. Berdasarkan hasil penelitian Adhimah (2008:47) yang menyimpulkan bahwa konsentrasi 0,04% efektif menghambat pertumbuhan
32 jamur C. gloeosporioides Penz. dengan persen penghambatan sebesar 74,40%. Konsentrasi ini dilakukan dengan melarutkan 0,4% gram pasta ekstrak rimpang kunyit dengan 10 ml DMSO 1%. G. Analisis Data Data yang diperoleh dari penelitian ini berupa rata-rata diameter pertumbuhan koloni jamur. Kemudian data hasil uji hayati dianalisis dengan menggunakan program SPSS versi 13 for window, data yang diperoleh terlebih dahulu dilakukan uji homogenitas. Selanjutnya dilakukan uji normalitas untuk mengetahui apakah data berdistribusi normal. Data tidak homogen dan tidak berdistribusi normal maka data di uji non parametrik. Selanjutnya data dianalisis dengan menggunakan Friedman (uji non parametrik perluasan uji Wilcoxon dengan melibatkan lebih dari dua variabel berhubungan) (Triherdadi, 2005:260). Apabila terdapat perbedaan yang signifikan antara lama dan suhu penyimpanan ekstrak rimpang kunyit dengan diameter pertumbuhan jamur C. gloeosporioides Penz. maka untuk membandingkan perbedaan yang signifikan antara data kelompok atau dengan kelompok lainnya diuji dengan uji Dunnett (Triherdadi, 2005:161). Besarnya persentase penghambatan diketahui dengan menghitung persentase penghambatan berdasarkan rumus (Cole et al., 2005:17; Embaby, 2006:424) yaitu sebagai berikut : % Penghambatan = kontrol - perlakuan x 100 kontrol
33 H. Analisis GC-MS Analisis GC-MS dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa dalam ekstrak rimpang kunyit yang kemudian dibandingkan dengan literatur yang telah ada. Analisis ini dilakukan di laboratorium Kimia Organik, Fakultas Pendidikan Matematika dan Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Indonesia. Parameter pengukuran analisis GC-MS dengan menggunakan alat Shimadzu QP 5050 A (Lampiran B Gambar 2.2) diantaranya suhu kolom 60 C, suhu detektor 230 C, suhu injektor 250 C, waktu analisa lima menit, dan volume injeksi 0,2 µl (Natta et al., 2008:338). Sebanyak 0,1 gram ekstrak dilarutkan dalam 2 ml etanol, ekstrak kunyit yang sudah dilarutkan kemudian dianalisis GC-MS.
34 I. Alur Penelitian Alur penelitian dapat dilihat pada Gambar 3.1. di bawah ini : Tahapan Persiapan o Pembuatan Medium PSA o Sterilisasi o Identifikasi Jamur o Pemeliharaan dan Perbanyakan Jamur o Identifikasi Rimpang Kunyit (C. domestica Val.) o Pembuatan Ekstrak Rimpang Kunyit o Penentuan Lama Penyimpanan Ekstrak Rimpang Tahap Pelaksanaan Uji Hayati dan Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Rimpang Kunyit Analisis GC-MS Analisis dan Pengolahan Data Kesimpulan Pelaporan Gambar 3.1. Bagan Alir Penelitian