BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Multidrug Resistant Tuberculosis (MDR-TB) merupakan tuberkulosis yang disebabkan oleh resistensi Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) terhadap minimal dua jenis obat antituberkulosis lini pertama, yaitu isoniazid dan rifampisin (ELF, 2009). Berdasarkan data global tahun 2013, tercatat sebanyak 480.000 kasus MDR-TB baru dan 300.000 kasus MDR-TB dari pengobatan TB sebelumnya (WHO, 2014). Indonesia menjadi salah satu dari 27 negara dengan kasus MDR-TB tinggi di dunia dengan kasus tahun 2013 sebanyak 5700 kasus baru dan 1100 kasus dari pengobatan TB sebelumnya (WHO, 2014). Tingginya kasus MDR-TB menjadi target pengendalian tuberkulosis di Indonesia (Depkes, 2005). Salah satu upaya pengendaliannya adalah melakukan deteksi dini kasus MDR-TB (ELF, 2009). MDR-TB terjadi karena adanya mutasi pada gen M. tuberculosis (ELF, 2009). Dalam perkembangan keilmuan mengenai mutasi tersebut, telah dilakukan penelitian pada beberapa gen yang bertanggung jawab terhadap resistensi isoniazid (INH) (Silva and Palomino, 2011). Adanya mutasi pada salah satu atau beberapa gen, yaitu katg, kasa, oxyr-ahpc, fura, inia, inib, inic, ndh, dan inha merupakan penyebab kekebalan terhadap INH (Syaifudin, dkk., 2009). Berdasarkan data penelitian, mutasi dengan frekuensi tinggi terjadi pada gen katg (50-95%) dan gen inha (8-43%). Sedangkan pada gen lainnya terjadi mutasi 1
2 dengan frekuensi lebih rendah (Zhang and Yew, 2009). INH adalah prodrug yang dapat diubah menjadi bentuk aktifnya oleh katalase peroksidase. Enzim ini dikode oleh gen katg pada M. tuberculosis. Apabila terjadi mutasi pada gen katg, maka INH tidak dapat aktif dalam tubuh (Syaifudin, dkk., 2009). Penelitian terhadap gen katg dengan teknik Polymerase Chain Reaction telah dilakukan pada isolat MDR-TB di Bali. Penelitian dilakukan pada daerah amplifikasi 2437-3160. Berdasarkan penelitian tersebut, mutasi terjadi pada kodon 315 dengan perubahan asam amino Serin menjadi Treonin. Titik mutasi lainnya adalah pada kodon 191 (Triptofan menjadi Arginin) dan kodon 234 (Alanin menjadi Glisin) (Dwiputri, 2013). Selain katg, inha juga bertanggung jawab terhadap resistensi isoniazid. Gen inha merupakan target kerja dari isoniazid dalam penghambatan sintesis asam mikolat bakteri (Banerjee, et al., 1994). Pada penelitian sebelumnya, dilakukan identifikasi mutasi promoter inha dengan daerah amplifikasi 7-290 pada isolat MDR-TB di Bali. Data penelitian tersebut menunjukkan adanya mutasi pada posisi -15 regio promoter inha dengan perubahan basa Sitosin (C) menjadi Timin (T) (Kusdianingrum, 2014). Pada isolat MDR-TB lokal di Bali belum dilakukan penelitian mengenai mutasi pada struktural gen inha. Berdasarkan beberapa penelitian, salah satunya pada isolat di Myanmar, dilaporkan adanya mutasi pada gen inha dari sebagian kecil isolat MDR-TB. Isolat yang resisten terhadap isoniazid tercatat sebanyak 2 dari 96 sampel (2,1%) dengan titik mutasi pada kodon 94 dengan perubahan asam amino Serin menjadi Alanin (Valvatne, et al., 2009). Pada penelitian lainnya
3 diketahui adanya jenis dan titik mutasi yang sama pada 4 strain M. tuberculosis (Brossier, et al., 2006). Berdasarkan hasil penelitian tersebut telah diketahui bahwa mutasi selalu ditemukan pada kodon 94 atau urutan basa nukleotida 280-282 gen inha. Sepasang primer diperlukan untuk dapat mengamplifikasi fragmen gen inha, dengan target pada kodon 94 yang letaknya pada bagian tengah dari produk PCR. Berdasarkan studi awal desain primer PCR dengan bantuan program Clone Manager Suite 6 (University of Groningen) yang telah dilakukan, diperoleh sepasang primer yang memenuhi kriteria terbaik untuk amplifikasi fragmen gen inha mencakup basa nukleotida 31 hingga 490. Mutasi pada promoter maupun regio inha biasanya diasosiasikan dengan adanya resistensi tingkat rendah. Isolat yang resisten terhadap INH dan bermutasi pada promoter atau regio inha dapat pula memiliki mutasi pada gen katg yang berakibat pada terjadinya resistensi tingkat tinggi (Guo, et al., 2006). Selain itu, mutasi pada promoter maupun gen inha dapat menunjukkan adanya resistensi silang terhadap salah satu obat antituberkulosis lini kedua, yaitu ethionamide. Metode multiplex PCR merupakan metode yang paling efisien dan ekonomis untuk mengamplifikasi beberapa sekuens secara simultan (Henegariu, et al., 1997). Aplikasi multiplex PCR telah berhasil dilakukan terhadap isolat resisten rifampisin di Bali, yaitu pada hulu dan daerah RRDR gen rpob (Astriani, 2014). Namun kemampuan metode multiplex PCR untuk mengamplifikasi promoter inha, gen katg dan gen inha secara simultan, belum diketahui.
4 1.2 Rumusan Masalah 1.2.1 Apakah metode multiplex PCR mampu mengamplifikasi regio promoter inha (7-290), fragmen gen inha (31-490) dan fragmen gen katg (2437-3160) isolat MDR-TB? 1.2.2 Apakah terjadi mutasi pada regio promoter inha (7-290), fragmen gen inha (31-490) dan fragmen gen katg (2437-3160) isolat MDR-TB dan apa jenis mutasinya? 1.2.3 Bagaimana perbedaan urutan asam amino yang terjadi pada fragmen gen inha (31-490) dan fragmen gen katg (2437-3160) isolat MDR-TB dibandingkan dengan data base wildtype-nya? 1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Mengetahui kemampuan metode multiplex PCR untuk mengamplifikasi regio promoter inha (7-290), gen inha (31-490) dan gen katg (2437-3160) isolat MDR-TB. 1.3.2 Mengetahui adanya mutasi dan jenis mutasi pada regio promoter inha (7-290), fragmen gen inha (31-490) dan fragmen gen katg (2437-3160) isolat MDR-TB. 1.3.3 Mengetahui perbedaan asam amino yang terjadi pada fragmen gen inha (31-490) dan fragmen gen katg (2437-3160) isolat MDR-TB dibandingkan dengan data base wildtype-nya.
5 1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1 Manfaat Keilmuan 1. Dapat mengetahui kemampuan metode multiplex PCR dalam mengamplifikasi regio promoter inha (7-290), fragmen gen inha (31-490) dan fragmen gen katg (2437-3160) isolat MDR-TB. 2. Menambah wawasan keilmuan mengenai adanya dan jenis mutasi pada regio promoter inha (7-290), fragmen gen inha (31-490) dan fragmen gen katg (2437-3160) isolat MDR-TB. 3. Menambah khazanah ilmu pengetahuan mengenai perbedaan urutan asam amino yang terjadi pada fragmen gen inha (31-490) dan fragmen gen katg (2437-3160) isolat MDR-TB dibandingkan dengan data base wildtype-nya. 1.4.2 Manfaat Praktis Hasil penelitian yang diperoleh diharapkan dapat digunakan dalam membantu perkembangan penelitian bioteknologi lainnya, khususnya pengaplikasian multiplex Polymerase Chain Reaction dalam mendeteksi adanya mutasi pada beberapa sekuens gen isolat MDR-TB secara bersamaan.