23 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret Agustus 2012. Perbanyakan benih dilakukan pada bulan Maret-Juni 2012 di KP Leuwikopo. Pengujian benih dilakukan pada bulan Juli-Agustus 2012 di Laboratorium Penelitian Pemuliaan Tanaman dan Laboratorium Ilmu dan Teknologi Benih, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah lot-lot benih dari galur-galur hasil iradiasi sinar gamma sebanyak 22 galur generasi M7 yaitu M50-45-9-12, M50-78-9-13, M50-97-8-12, M100-29A-42-10, M100-29A-42-14, M100-29A-42-15, M100-46- 44-6, M100-96-53-6, M100-96-53-7, M150-24-48-2, M150-29-44-10, M150-40- 65-5, M150-69-47-2, M200-13-47-5, M200-20-52-11, M200-20-52-3, M200-39- 69-6, M200-62-54-4, M200-64-51-2, M200-6B-58-7, M200-79A-50-5, M200-93-49-13 dan varietas pembanding Argomulyo yang merupakan varietas asal (wildtype) dan Tanggamus yang merupakan varietas toleran masam, larutan alkohol 95%, aquades, kertas merang, plastik, plastik wrap, tisu dan label. Alat yang digunakan adalah alat pengusangan cepat APC IPB 77-1M, alat pengecambah benih, alat pengepres kertas, oven, cawan porselin, desikator, pinset, alat pengukur hambatan, gelas, gelas ukur, timbangan, dan bak plastik. Metode Percobaan ini disusun menggunakan Rancangan Petak Tersarang. Galur tersarang dalam waktu deraan. Waktu deraan yang digunakan yaitu 0, 20, 40, 60, dan 80 menit dan galur yang tersarang adalah 22 galur kedelai dan dua varietas pembanding. Percobaan menggunakan tiga ulangan, sehingga terdapat 360 satuan percobaan.
2412 Y ijk Model liniernya adalah : Y ijk = µ + α i + (τ/α) ik + β j + (αβ) ij + ε ijk = respon pengamatan faktor 1 (waktu deraan) ke-i, faktor 2 (galur) ke-j dan ulangan ke-k µ = rataan umum α i = pengaruh faktor 1 (waktu deraan) ke-i (τ/α) ik = pengaruh ulangan ke-k tersarang dalam waktu deraan ke-i β j (αβ) ij ε ijk = pengaruh faktor 2 (galur) ke-j = interaksi waktu deraan ke-i dengan galur ke-j = pengaruh galat percobaan pada waktu deraan ke-i, galur ke-j, dan ulangan ke-k Data yang diperoleh dianalisis menggunakan uji F taraf 5%. Hasil yang menunjukkan berpengaruh nyata pada tiap peubah diuji lanjut dengan uji Dunnet. Uji korelasi Pearson juga dilakukan untuk menentukan keeratan hubungan antara dua peubah dan analisis regresi untuk menentukan faktor genetik (galur) yang paling cepat mengalami kemunduran akibat pengusangan cepat. Peubah bobot 100 butir benih dianalisis menggunakan Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) karena menyesuaikan hasil dari lapangan. Pelaksanaan Percobaan Benih hasil panen diusangkan cepat secara kimia untuk mendapatkan beberapa lot kemunduran benih. Persiapan benih sebelum pengusangan adalah pelembaban benih diantara kertas merang lembab selama 12 jam. Benih yang telah dilembabkan kemudian dimasukkan ke dalam botol dan dilakukan penderaan dengan uap etanol 95% dalam APC IPB 77-1M pada tiap waktu deraan. Uji viabilitas benih dengan metode UKDdp menggunakan kertas merang. Penggunaan kertas merang karena memiliki daya absorpsi air yang tinggi seperti lazimnya kertas saring, dan harganya yang murah. Kelebihan kertas dari pasir untuk uji viabilitas adalah praktis dalam dalam mendapatkan kondisi yang terkontrol dan ruang yang diperlukan untuk penempatan materi yang diuji lebih sedikit.
25 13 Tingkat kemunduran benih dibuat lima taraf, yaitu T0 tanpa penderaan yang digunakan sebagai kontrol, T1 = 20 menit, T2 = 40 menit, T3 = 60 menit, T4 = 80 menit (Imaniar, 2012). Setelah diusangkan, benih dimasukkan ke dalam botol untuk mengurangi pengaruh lingkungan. Pengujian dan Pengamatan Peubah pengujian untuk analisis mutu fisiologis benih meliputi Daya Berkecambah (DB), Indeks Vigor (IV), Potensi Tumbuh Maksimum (PTM) dan Kecepatan Tumbuh (K CT ) menggunakan substrat kertas merang dengan metode Uji Kertas Digulung Didirikan dalam plastik (UKDdp). Untuk pengujian DB, IV, dan PTM menggunakan 25 butir benih yang dibuat dua gulungan dan perhitungan K CT menggunakan 25 butir benih satu gulungan. Pengecambahan dilakukan dalam alat pengecambah benih. 1. Bobot 100 butir Perhitungan bobot 100 butir dilakukan hanya diawal sebelum perlakuan pengusangan (sebelum dilembabkan). Perhitungan menggunakan tiga ulangan yang sesuai dengan ulangan di lapangan. 2. Daya Berkecambah (DB) Daya Berkecambah (DB) adalah total kecambah normal yang dapat hidup pada kondisi optimal. Daya berkecambah merupakan tolak ukur viabilitas potensial (Vp) karena nilai daya berkecambah mensimulasi persentase benih yang mampu tumbuh dan berproduksi normal dalam kondisi optimum (Mugnisjah, 2007). Pengamatan daya berkecambah benih yaitu berdasarkan pada jumlah kecambah normal pada hari ke-3 dan ke- 5. Pada hari terakhir dihitung pula benih mati dan abnormal. Rumus untuk menghitung daya berkecambah benih adalah: KN I KN II : Jumlah kecambah normal pada pengamatan ke-1 : Jumlah kecambah normal pada pengamatan ke-2
26 14 3. Indeks Vigor (IV) Pengamatan untuk perhitungan indeks vigor dilakukan pengamatan ke-1 (hari ke-3) dengan menghitung jumlah kecambah normal. Rumus menghitung indeks vigor: KN I : Jumlah kecambah normal pada pengamatan ke-1 4. Potensi Tumbuh Maksimum (PTM) Potensi Tumbuh Maksimum (PTM) adalah kemampuan benih untuk tumbuh dalam keadaan normal maupun abnormal dengan batas minimal keluarnya akar dari benih. Pengamatan dilakukan pada pengamatan ke-2 (hari ke-5). Rumus perhitungan potensi tumbuh maksimum: KN : Jumlah kecambah normal KA : Jumlah kecambah abnormal 5. Kecepatan Tumbuh (K CT ) Pengamatan kecepatan tumbuh yaitu benih diamati setiap hari sampai hari ke-5 dengan menghitung jumlah kecambah normal. Penilaian dilakukan dengan cara yang digunakan Throne berry dan Smith (dalam Sadjad, 1972) atau rumus penetapan Sadjad tahun 1999. Rumus untuk menghitung kecepatan tumbuh adalah: N n t : Persentase kecambah normal setiap waktu pengamatan : Akhir waktu pengamatan : Waktu pengamatan
27 15 6. Kadar Air (KA) Kadar air benih adalah jumlah air yang dapat ditahan oleh benih. Pengamatan kadar air benih menggunakan metode langsung, yaitu dengan menimbang benih sebelum dan sesudah dimasukkan ke oven bersuhu 105 o C selama 24 jam. Benih yang digunakan untuk pengukuran kadar air benih adalah 10 butir tiap ulangan sehingga dibutuhkan 30 butir tiap galur pada tiap taraf. Perhitungan dengan hasil penimbangan benih sebelum dan sesudah dioven dengan menggunakan rumus penetapan ISTA tahun 2007. Rumus untuk menghitung kadar air benih adalah: M1 : Berat cawan sebelum dioven M2 : Berat cawan + benih sebelum dioven M3 : Berat cawan + benih setelah dioven 7. Nilai Hambatan Listrik (NHL) Pengukuran nilai hambatan listrik benih menggunakan alat pengukur hambatan listrik. Benih sebanyak 25 butir direndam selama 24 jam dalam 100 ml aquades. Setelah 24 jam benih diaduk untuk memastikan pencampuran. Pengukuran NHL merupakan cara cepat mengetahui vigor benih. Air rendaman akan diukur nilai hambatannya, semakin tinggi nilai hambatan listrik, nilai daya hantar listrik semakin rendah. Analisis Data Data kuantitatif dari hasil penelitian dianalisis per waktu deraan untuk semua galur. Rancangan yang digunakan adalah Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) karena menyesuaikan dengan rancangan saat perbanyakan benih di lapangan. Selanjutnya adalah uji Bartlett untuk mengetahui kehomogenan ragam galat. Selain itu juga uji kenormalan data dan menentukan nilai koefisien keragaman (KK). Data yang sudah dianalisis per waktu deraan kemudian dilakukan analisis ragam gabungan tersarang untuk mengetahui pengaruh
16 28 interaksi faktor waktu deraan dan galur. Contoh hasil analisis ragam gabungan dapat dilihat pada Tabel 1. Sumber Keragaman Tabel 1. Analisis ragam gabungan dan komponen pendugaan ragam Derajat Bebas (DB) Kuadrat Tengah (KT) E(KT) Waktu w-1 M5 σ 2 e + g.σ 2 r/ w + gr σ 2 g Ul (Waktu) w(r-1) M4 σ 2 e + g.σ 2 r/ w Galur g-1 M3 σ 2 e + r.σ 2 g*w + r.w σ 2 g Galur*Waktu (g-1)(w-1) M2 σ 2 e + r.σ 2 g*w Galat w(g-1)(w-1) M1 σ 2 e Keterangan : w (waktu deraan), g (genotipe/galur), r (ulangan) Penentuan korelasi antar karakter dilakukan menggunakan rumus: x = ragam sifat pertama y = ragam sifat kedua Cov xy = peragam karakter sifat pertama dan sifat kedua Pendugaan regresi linier sederhana antar pasangan karakter/ sifat menggunakan rumus: Y = a + b T Sumbu Y adalah karakter viabillitas dan vigor benih, T adalah waktu pengusangan benih (waktu deraan), dan b adalah kemiringan garis. Perhitungan komponen ragam dan nilai heritabilitas dalam arti luas (h 2 bs) adalah untuk menentukan karakter yang dapat dijadikan karakter seleksi. Pendugaan komponen ragam dapat diperoleh dari : 1. Ragam Fenotipe (σ 2 p) = σ 2 g + σ 2 g*e / w + σ 2 e /rw 2. Ragam Genotipe (σ 2 g) = (M3-M2)/ rw 3. Ragam Interaksi (σ 2 g*e) = (M2-M1)/ r 4. Ragam Lingkungan (σ 2 e) = M1 dengan r (ulangan), w (waktu deraan), dan M1-M3 (kuadrat tengah) Pendugaan ragam fenotipe adalah dengan pendekatan ragam fenotipe mean basis.
17 29 Heritabilitas merupakan proporsi dari total ragam fenotipe yang disebabkan oleh faktor genetik. Heritabilitas arti luas adalah perbandingan antara ragam genetik total dan ragam fenotipe (Basuki, 2005). Perhitungan heritabilitas luas menggunakan rumus: h 2 bs = σ 2 g / σ 2 p * 100% h 2 bs σ 2 g σ 2 p : Heritabilitas arti luas : Ragam genetik : Ragam fenotipe Setiap sebaran data pada masing-masing karakter pengamatan pada populasi dapat dihitung nilai koefisien keragaman genetiknya (KKG) (Allard, 1960). KKG merupakan nisbah antara akar kuadrat tengah ragam genetik dengan rataan umum. Nilai KKG dapat dihitung dengan rumus: KKG = ( σ 2 g / rataan umum) x 100%