26 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Jenis penelitian ini merupakan jenis penelitian deskriptif untuk karakterisasi gen virulen dan eksperimental pada uji patogenesitas dengan menggunakan LD 50 96 jam (Reed & Muench, 1983). B. Subjek dan Sampel Populasi Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah isolat bakteri Aeromonas hydrophila yang terdapat di Balai Riset Budidaya Air Tawar (BRBAT) Bogor. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat terpilih bakteri Aeromonas hydrophila strain A2 berasal dari ikan botia. C. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dimulai pada bulan Maret 2012 sampai dengan Agustus 2012 yang dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Universitas Pendidikan Indonesia, Jalan Dr. Setiabudhi No.299 Bandung. D. Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdapat di Laboratorium Mikrobiologi Universitas Pendidikan Indonesia. Daftar alat dan bahan dapat dilihat pada lampiran 1 dan 2.
27 E. Prosedur Penelitian 1. Tahap Persiapan a. Pembuatan Medium sebagai Media Tumbuh Bakteri Aeromonas hydrophila Medium yang digunakan adalah medium TSA (Trypic Soy Agar) dan RS (Rimler Shotts). Alat-alat kaca dan plastik yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan. Alat kemudian dibungkus dengan kertas pembungkus setelah dimasukan ke dalam plastik untuk dilakukan sterilisasi panas lembab dengan cara dimasukan kedalam autoklaf selama 15-20 menit pada suhu 121 C dan tekanan 15 lb. b. Perbanyakan dan Pemeliharaan Kultur Aeromonas hydrophila Kultur murni Aeromonas hydrophila yang telah didapatkan dari Balai Riset Budidaya Air Tawar (BRBAT) Bogor, di sub kultur dengan cara mengambil satu ose kultur murni Aeromonas hydrophila, kemudian di tanam ke dalam medium TSA miring dan diinkubasi pada suhu 28 C. 2. Tahap Penelitian a. Karakterisasi Isolat A. hydrophila Karakterisasi isolat bakteri Aeromonas hydrophila dilakukan dengan cara biokimia dan biologi molekuler. Secara biokimia dilakukan dengan Standar Nasional Indonesia (2009) untuk Aeromonas hydrophila dan secara biologi molekuler dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan primer spesifik untuk Aeromonas hydrophila yang di disain oleh Dorsch,et.al,.
28 (1994). Primer spesifik ini pun telah banyak digunakan oleh beberapa peneliti seperti Gardenia, et.al,.(2010), Nielsen, et.al., (2001) dan Delabre, et.al.,(1998). 1) Karakterisasi Biokimia a) Uji Motilitas Isolat diambil dengan jarum ose lurus, kemudian diinokulasikan dengan menggunakan media semi solid (SIM Agar) lalu diinkubasikan pada suhu 28 C selama 18-24 jam. b) Uji Oksidase Kertas saring dibasahi dengan pereaksi oksidasi, lalu diambil satu loop isolat bakteri, goreskan pada kertas saring yang sudah dibasahi pereaksi oksidasi. Reaksi oksidasi positif ditandai dengan munculnya warna biru keunguan pada goresan. c) Uji Oksidatif- fermentatif (O/F) Tabung berisi media O/F disiapkan untuk diinokulasikan bakteri dengan cara ditusukkan. Satu tabung diisi dengan parafin cair steril hingga ketinggian 1cm diatas permukaan media O/F sedangkan tabung lainnya tanpa parafin cair. Reaksi fermentatif ditandai dengan perubahan warna media pada tabung yang diisi parafin cair dari hijau menjadi kuning. d) Uji Rimmler-Shoots (RS) Kultur bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose, bakteri diinokulasikan ke dalam media RS lalu diinkubasi pada suhu 37 selama 18-24 jam. Penampakan koloni dilihat dengan hasil positif menunjukan berwarna kuning tanpa warna hitam di tengah koloni.
29 e) Pewarnaan gram Gelas objek yang telah dibersihkan dari lemak dengan alkohol 70% dan diberi label. Teteskan aquades steril pada permukaan gelas objek. Kemudian isolat diambil dengan jarum ose steril, dicampur dengan aquades dan diulas merata pada permukaan gelas objek. Dilakukan fiksasi panas dengan melewatkan preparat di atas api. Sediaan mikroskop yang sudah kering ditetesi dengan kristal violet secara merata dan didiamkan selama satu menit. Kemudian teteskan larutan alkohol aseton pada preparat sampai merata dan diamkan maksimal 30 detik. Preparat di cuci dengan aquades dan dikeringkan. Kemudian teteskan larutan safranin pada preparat sampai merata dan diamkan selama dua menit. Dicuci kembali dengan aquades dan dikeringkan. 2) Karakterisasi Biologi Molekuler a) Kultivasi bakteri sampel Isolat bakteri yang telah didapatkan dari BRBAT Bogor yang berasal dari ikan botia, ditumbuhkan kembali atau di sub kultur ke dalam medium TSA (Trypic Soy Agar) di cawan petri untuk mendapatkan biakan murni dari isolat Aeromonas hydrophila. Kemudian diinkubasikan pada suhu 28 C selama 24 jam pada kondsi aerob. Keesokan harinya, bakteri yang telah tumbuh pada media TSA dipindahkan ke media TSB (Trypic Soy Broth) dengan dimasukkan sebanyak satu ose kultur padat ke dalam TSB kemudian diinkubasikan pada suhu 28 C dengan lama inkubasi selama 14 jam. Koloni bakteri tunggal yang tumbuh pada medium cair tersebut kemudian diisolasi DNAnya.
30 b) Isolasi DNA Bakteri Isolasi DNA mengacu pada proses Isolasi DNA dengan beberapa modifikasi pada beberapa langkah proses isolasi. Hasil kultivasi bakteri yang merupakan kultur cair diambil sebanyak 1,5 ml dan dimasukkan ke tabung ependorf kemudian disentrifugasi pada kecepatan 5.000 rpm selama dua menit. Supernatan pada tabung ependorf dibuang dan pada pelet yang terbentuk ditambahkan 500µl TE ph 8,0 dan 100µl SDS, pelet tersebut dihomogenkan dengan cara dibolak balik pelan. Hal ini dimaksudkan untuk mendenaturasi protein sehingga membran sel akan mengalami lisis. Setelah pelet tersebut homogen kemudian ditambahkan 10µl proteinase-k dan diinkubasi pada suhu 37 C selama satu jam. Selama proses inkubasi, tabung dibolak balik setiap 15 menit sekali. Selanjutnya, pada pelet ditambahkan NaCl 5 M sebanyak 100 µl. Kemudian ditambah 100µl CTAB yang telah dipanaskan pada suhu 65 C selama lima menit untuk menghancurkan makromolekul dalam sel. Kemudian isolat DNA diinkubasikan pada suhu 65 C selama 20 menit. Setelah proses inkubasi selesai dilanjutkan dengan penambahan 500µl Chloroform:Isoamil alkohol untuk membantu proses denaturasi protein. Selain itu Cl ini juga berfungsi sebagai antibuih ketika dikocok. Kemudian, sentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama lima menit, setelah itu dikocok cepat kemudian supernatan dibuang dan ditambahkan kembali 500µl Chloroform:Isoamil alkohol. Sentrifugasi kembali pada kecepatan dan waktu yang sama sampai cukup bersih dari protein.
31 Pada tabung ependorf akan terbentuk tiga fasa, yaitu fasa atas, tengah dan bawah. Kemudian fasa atas tersebut diambil dengan ujung tips yang steril. Lalu fasa ini dipindahkan ke tabung ependorf yang baru, dan ditambahkan Etanol absolut dingin sebanyak dua kali volume fasa tersebut. Tabung ependorf digoyang pelan dengan cara dibolak-balik minimal 50 kali lalu disimpan pada suhu -20 C selama 20 menit untuk melepas molekul air. Setelah proses pendinginan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama lima menit sehingga terbentuk dua fasa yaitu supernatan dan pelet. Selanjutnya supernatan dibuang sehingga yang tersisa hanya pelet DNA. Pelet ini kemudian ditambahkan satu ml Etanol 70% dingin, lalu disentrifugasi pada 13.000 rpm selama lima menit. Setelah sentrifugasi supernatan dibuang, dan dikeringkan untuk menguapkan sisa-sisa etanol. Ditambahkan ke dalam tabung Ependorf yang berisi pelet tersebut sebanyak 20µl TE steril untuk melarutkan DNA kemudian diinkubasikan pada suhu 37 C selama 5 menit. Simpan pada suhu -20 C. c) Karakterisasi Primer Spesifik dan Gen Virulen dengan Metode PCR Fragmen DNA gen virulen di amplifikasi menggunakan teknik PCR. Amplifikasi PCR dilakukan dengan total volume reaksi 25µl yang berisi 12,5 µl 2x KAPA2G Fast ReadyMix; 8 deion steril; 1,25 µl masing-masing primer (forward dan reverse) gen virulen dan 2 µl DNA template, pada pelaksanaan dapat digunakan ½ volume. Campuran reaksi tersebut dimasukkan ke dalam
32 thermocycler Ependorf dengan program suhu sesuai dengan gen virulen yang digunakan. Program PCR untuk primer spesifik A. hydrophila adalah dengan suhu awal denaturasi 95 C selama 4 menit terdiri dari 30 siklus, denaturasi 95 C selama 30 detik, Annealing 54 C selama 45 detik, elongasi 72 C selama 30 detik dan diakhiri dengan final elongasi 72 C selama 10 menit (Gardenia, et.al., 2010). 95 (4 ) 95 (30 ) 72 (30 ) 72 (10 ) 54 (45 ) gambar 3.1 Program PCR Primer Spesifik Program PCR untuk gen virulen dengan metode touchdown suhu awal denaturasi 94 C selama 5 menit terdiri dari 45 siklus, denaturasi 94 C selama 30 detik, anneling 54 C (aera) (Gardenia, et. al.,2010), 58 C (AscV dan aopb) (Carvalho-Castro,et al.,2010), 54-62 C (AexT) (Vilches, et al., 2009) (menggunakan metode PCR touchdown) selama 30 detik, elongasi 72 C selama 60 detik dan final elongasi 72 C selama 10 menit (Li, et.al. 2010). 94 (5 ) 94 (30 ) 72 (60 ) 94 (5 ) 94 (5 ) 94 (5 ) 72 (60 ) 72 (60 ) 72 (60 ) 72 (10 ) 54 (30 ) 58 (30 ) 58 (30 ) 54-58 (30 ) gambar 3.2 Program PCR touchdown Gen Faktor Virulen
33 Hasil PCR ini dianalisis dengan elektroforesis gel agarose 2%. 5µl hasil amplikon dicampur terlebih dahulu dengan loading buffer sebanyak 2 µl. Elektroforesis dilakukan selama 40 menit pada tegangan 100 volt dengan buffer TBE 1x sebagai running buffer. Gel diwarnai dengan 0,5 µg/ml Ethidium bromida selama tiga menit dan pembersihan dengan deion steril selama lima menit. Hasil elektroforesis dilihat dengan alat sinar UV pada panjang gelombang 312 nm dan didokumentasikan menggunakan kamera digital. Pita yang dilihat adalah yang tebal dan jelas terlihat. Marker yang digunakan adalah yang berukuran 100 pb. b. Aklimasi Ikan Perlu dilakukan penyesuaian diri ikan dengan kondisi di laboratorium dan akuarium. Akuarium yang digunakan disertai sistem aerasi yang sudah desinfektan dengan cara menggunakan larutan kalium permanganat (KMnO 4 ) 2,5 mg/l selama 24 jam. Aklimasi dilakukan pada suhu 28 C selama 14 hari di akuarium aklimasi dan. Pada penelitian kali ini aklimasi dilakukan selama dua minggu dan ikan yang digunakan adalah ikan gurami untuk uji patogenesitas. Setiap 2 kali sehari diberi makan sebanyak 72,5 gram untuk 50 ekor ikan. c. Pembuatan Kurva Pertumbuhan A. hydrophila Kurva tumbuh menggambarkan pertumbuhan mikroba dalam suatu kultur. Pertumbuhan kurva tumbuh bertujuan untuk menentukan umur inokulum Aeromonas hydrophila terbaik dalam medium sebelum diinjeksikan ke gurami.
34 Metode yang digunakan dalam pembuatan kurva ini adalah metode yang dilakukan Cappuccino (1987) dengan beberapa modifikasi. 1) Kurva tumbuh A. hydrophila Bakteri uji diaktivasi terlebih dahulu dengan menginokulasikan satu ose bakteri yang diambil dari biakan murni ke dalam labu erlenmeyer yang berisi 10 ml medium TSB (Trypic Soy Broth) lalu diinkubasikan pada waterbath shaker dengan kecepatan 120 rpm pada suhu 28 C selama 24 jam. Kemudian dipindahkan ke dalam medium TSB 90 ml selama 24 jam dan dilihat setiap dua jam sekali. Metode yang digunakan untuk membuat kurva tumbuh ini dinamakan metode turbidimetri. Setiap 2 jam, diambil sebanyak 5ml dari labu kultur, lalu dimasukkan ke dalam cuvete. Kemudian nilai absorbansi dihitung menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Kurva tumbuh dibuat berdasarkan hasil hubungan nilai absorbansi dengan waktu. Dari kurva tumbuh ini dapat diketahui umur biakkan pada saat mencapai fase log. Pada fase log inilah ditemukan laju pertumbuhan Aeromonas hydrophila sehingga umur inokulum untuk uji aktivasi dapat ditentukan (Cappuccino, 1987). 2) Penentuan Umur Inokulum Dalam menentukan umur inokulum dapat dilakukan dengan metode cawan tuang. Satu ose Aeromonas hydrophila ditumbuhkan dalam medium TSB 10 ml, dikocok dengan water bath pada kecepatan 120 rpm dengan suhu 28 C selama 24 jam. Kemudian dari medium TSB 10 ml dituangkan ke dalam 90 ml TSB dan setiap 2 jam sekali di cek OD dan dituangkan ke dalam cawan dengan medium
35 TSA, diinkubasi pada suhu 28 C selama 24 jam dan dikocok pada kecepatan 120 rpm. Kemudian diamati jumlah bakteri dengan kisaran yang dapat dihitung 30-300 koloni (Cappuccino, 1987). Penentuan umur inokulum yang optimal dapat dilakukan dengan cara menghitung laju pertumbuhan yang paling pesat menggunakan rumus : µ = Log Ax Log Ao 2,031. Δt Keterangan : µ : laju pertumbuhan Ax : Jumlah populasi bakteri setelah waktu tertentu Ao : Jumlah populasi awl bakteri Δt : Selang waktu antara pengukuran jumlah populasi awal bakteri (Ao) dan populasi setelah waktu tertentu (Ax) 3) Kurva baku A. hydrophila Pembuatana kurva dilakukan untuk mengetahui jumlah bakteri dalam satu inokulum. Pertama-tama dilakuakan aktivasi bakteri menggunakan medium TSB sebanyak 10 ml yang sebelumnya dimasukkan biakan bakteri sebanyak satu ose. Kemudian kultur diinkubasi pada waterbath shaker dengan kecepatan 120 rpm dengan suhu 28 C selama 24 jam. Setelah 24 jam, biakan bakteri yang telah diaktivasi tadi ditambahkan ke dalam labu erlenmeyer lain yang berisi 90 ml medium TSB lalu diinkubasi lagi dengan kecepatan 120 rpm dan suhu 28 C selama waktu yang dibutuhkan untuk mencapai fase logaritmik. Fase logaritmik ini dapat diketahui berdasarkan hasil pembuatan kurva tumbuh bakteri. Pada fase
36 ini kemudian di ambil dengan memasukkan 5 ml inokulum ke dalam cuvete untuk dihitung nilai absorbansi dengan panjang gelombang 540 nm. Bersamaan dengan itu, diambil 1 ml biakan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml NaCl steril untuk pengenceran 10-1 lalu dihomogenkan dengan vortex. Dari tabung pengenceran kemudian diambil kembali sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml NaCl steril lain untuk pengenceran 10-2 hingga 10-9. Pada pengenceran 10-8, 10-7, 10-6 diambil 1 ml biakan, lalu dimasukan ke dalam cawan petri steril, kemudian dicampurkan dengan 9 ml medium TSA. Biakan diinkubasikan pada suhu 28 C selama 24 jam. Jumlah koloni bakteri uji yang tumbuh dihitung dengan menggunakan colony counter. Kurva baku dibuat berdasarkan hasil regersi linier yang menghubungkan antara kerapatan optic (Optical Density) sebagai sumbu X dan hasil perhitungan jumlah koloni bakteri sebagai sumbu Y. d. Re-virulensi dengan Medium Agar Darah Karakter dari bakteri patogen adalah kemampuannya untuk melakukan infeksi pada inangnya, hal inilah yang menjadi dasar perlu dilakukannya re-virulensi bakteri A. hydrophila untuk mengaktifkan kembali kemampuan virulensi pada inangnya. Pada tahap ini digunakan medium agar darah dengan menggunakan darah kuda ditambahkan antibiotik ampicilin. Satu koloni bakteri yang telah ditubuhkan dan di purifikasi diambil dengan jarum ose kemudian di purifikasi pada medium agar darah di cawan petri kemudian disimpan pada suhu 37 C. Kemudian esok harinya diamati dan dilakukan kembali purifikasi. Hal ini
37 dilakukan sebanyak minimal tiga kali. Sebagai bahan penyuntikan maka diambil satu koloni dari hasil purifikasi yang terbentuk (BD, 2012). Dalam pelaksanaan re-virulensi pada agar darah ini dapat diketahui karakter hemolitik dari bakteri Aeromonas hydrophila dengan munculnya luas zona bening yang terbentuk. e. Patogenesitas Bakteri A. hydrophila pada ikan Gurami Infeksi ikan dilakukan dengan cara melarutkan satu ose inokulum bakteri Aeromonas hydrophila pada medium TSB 10 ml kultur kemudian diinkubasi pada waterbath shaker dengan kecepatan 120 rpm dengan suhu 28 C selama 24 jam. Setelah 24 jam, biakan bakteri yang telah ditumbuhkan tadi ditambahkan ke dalam labu erlenmeyer lain yang berisi 90 ml medium TSB lalu diinkubasi lagi dengan kecepatan 120 rpm dan suhu 28 C selama waktu umur inokulum yang optimal. Kemudian disentrifugasi terbentuk dua fasa, fasa cair dibuang dan pelet di larutkan dalam NaCl 5 ml. Kemudian, dilakukan pengenceran 100x dan di cek OD dari bakteri tersbut, hasil OD yang didapat kemudian dimasukan kedalam persamaan hasil kurva baku. Sebagai dosis penyuntikan maka perlu diencerkan kembali sesuai dengan hasil perhitungan dari persamaan dan disesuaikan dengan konsentrasi yang dibutuhkan yaitu 1x10 8, 1x10 6, 1x10 4. Sebelum penyuntikan ikan dikondisikan dala keadaan stres dengan cara satu hari sebelumnya tidak diberi makan dan pada saat penyuntikan dibuang air dalam air sehingga tersisa sekitar 5 cm tinggi air. Penyuntikan dilakukan dalam air dengan suhu 25 C dan diambil 0,1ml disuntik di bagian intraperitoneal. Ikan yang
38 telah disuntikan dikembalikan ke dalam akuarium dan diamati selama 96 jam atau sampai timbul gejala klinis. f. Pengamatan 1) Pengamatan dilakukan selama 96 jam dengan melihat angka kematian dari ikan gurami. 2) Apabila dalam waktu pengamatan terdapat ikan yang mati maka ikan diambil dan di cek dengan medium RS dan dicatat waktu kematiannya. 3) Pengamatan yang dilakukan dengan melihat gejala klinis yang ditimbulkan dan ikan yang mati. 4) Isolasi dan identifikasi bakteri pada ikan gurami yang mati ataupun yang menimbulkan gejala klinis untuk memastikan penyebab kematiannya dengan menggunakan medium selektif RS yang kemudian diidentifikasi secara biokimia dan molekuler. g. Analisis Data dengan LD 50 96 jam Pengaruh bakteri Aeromonas hydrophila yang diberikan dengan injeksi pada ikan gurami dilihat dari jumlah persentase jumlah ikan yang hidup pada tiap dosis yang diberikan dengan perhitungan LD 50 (Reed & Muench 1983).
39 h. Alur Penelitian Urutan penjelasan mengenai prosedur penelitian yang dilakukan sesuai dengan alur penelitian adalah sebagai berikut : Persiapan Penelitian 1. Pembuatan medium 2. Perbanyakan kultur murni Aeromonas hydrophila Karakterisasi bakteri 1. Biokimia (SNI, 2009) 2. Biologi molekuler (Li,2010) Aklimasi ikan gurami selama minimal 1 minggu Re-virulensi dengan medium agar darah Uji Patogenesitas ke ikan gurami (Reed, 1983) Analisis data
Gurami (Osphronemus Gouramy) 40