3. METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Waktu dan tempat Penelitian Penelitian telah dilaksanakan dari bulan Agustus 2006 sampai Juli 2007, bertempat di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan Departemen Teknologi Hasil Perairan Institut Pertanian Bogor. 3.2. Bahan dan Peralatan 3.2.1. Bahan Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah tanaman X. granatum terdiri dari akar, batang, daun, daging buah dan biji yang diperoleh dari Pulau Bakau, desa Muara Kintap Kabupaten Tanah Laut Kalimantan Selatan. Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah heksana, etil asetat dan metanol untuk ekstraksi senyawa bioaktif X. granatum. Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan bakteri S. aureus dan E. coli (klinis dan non klinis), media Mueller Hinton, paper disc, ekstrak metanol X. granatum, kloramfenikol dan ampisilin sebagai kontrol positif. Uji fitokimia meliputi uji alkaloid menggunakan kloroform, amonia, pereaksi Dragendorff (kalium tetraiodobismutat), Meyer (kalium tetraiodomerkurat) dan Wagner (iodium dalam kalium iodida). Uji saponin menggunakan akuades, uji flavonoid menggunakan H 2 SO 4 pekat dan uji tanin menggunakan FeCl 3. Penapisan ekstrak kasar menggunakan CHCl 3, H 2 SO 4, MeOH dan NH 3 OH. Penapisan alkaloid menggunakan EtOH, NH 3 OH, CHCl 3 dan HCl. Flavonoid penapisannya menggunakan akuades panas, heksana, CHCl 3, Et 2 O, dan butanol. Penapisan tanin menggunakan heksana, aseton, akuades, asam askorbat, CHCl 3 dan EtOAc. Pengujian aktivitas inhibitor topoisomerase I menggunakan gel agarosa dan pewarnaan dengan etidiumbromida, buffer TAE/Tris Acid EDTA, MgCl 2, Enzim DNA topoisomerase I dari TopoGen, serta comptothecin sebagai kontrol positif inhibitor topoisomerase I.
18 3.2.2. Peralatan Alat-alat yang digunakan yaitu timbangan digital dan peralatan gelas. Alat untuk ekstraksi senyawa bioaktif yaitu waring blender, hot plate, pengaduk magnit, erlemenyer, evaporator vakum. Elektroforesis digunakan untuk pengujian aktivitas inhibitor topoisomerase I. Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan tabung reaksi, vortex, cawan petri, lemari pendingin, inkubator. 3.3. Prosedur Penelitian Penelitian penapisan antibakteri dan inhibitor topoisomerase I dari X. granatum terdiri dari beberapa tahap yaitu: 1) ekstraksi senyawa bioaktif akar, batang, daun, daging buah dan biji X. granatum dengan pelarut heksana, etil asetat dan metanol, 2) pengujian inhibitor topoisomerase I terhadap semua ekstrak kasar X. granatum, 3) pengujian fitokimia dan antibakteri terhadap ekstrak kasar metanol akar, batang, daun, daging buah dan biji X. granatum, 4) penentuan minimum inhibitor topoisomerase I terhadap ekstrak kasar metanol batang X. granatum, 5) penapisan senyawa kimia dari ekstrak metanol batang X. granatum, 6) penapisan fraksi alkaloid, flavonoid dan tanin dari ekstrak metanol batang X. granatum, 7) pengujian aktivitas antibakteri dari fraksi alkaloid, flavonoid dan tanin ekstrak metanol batang X. granatum. Diagram alir keseluruhan tahapan penelitian penapisan antibakteri dan inhibitor topoisomerase I dari X. granatum disajikan pada Gambar 9.
19 X. granatum akar, batang, daun, daging buah & biji) Heksana Ekstraksi sampel Etil asetat Metanol Ekstrak kasar dalam heksana, etil asetat & metanol Pembersihan ekstrak Pencucian berulang Ekstrak heksana Ekstrak etil asetat Ekstrak metanol Uji inhibisi Topo. I Uji fitokimia Ekstrak metanol Uji antibakteri Uji MIC Topo. I Ekstrak metanol batang Penapisan senyawa kimia Penapisan fraksi Fraksi alkaloid Fraksi flavonoid Fraksi tanin Uji fitokimia & antibakteri Fraksi terpilih Gambar 9 Diagram alir keseluruhan tahapan penelitian penapisan antibakteri dan inhibitor topoisomerase I dari X. granatum 3.3.1. Ekstraksi komponen aktif Ekstraksi komponen aktif dari X. granatum menggunakan tiga macam pelarut berdasarkan tingkat kepolarannya yaitu heksana (non polar), etil asetat (semi polar) dan metanol (polar). Proses ekstraksi senyawa aktif dari tanaman X. granatum disajikan pada Gambar 10 dan prosedur ekstraksi pada Lampiran 1.
20 Sampel X. granatum Maserasi dengan heksana selama 24 jam Penyaringan Filtrat Evaporasi Ekstrak heksana Maserasi dengan etil asetat selama 24 jam Penyaringan Filtrat Evaporasi Ekstrak etil asetat Maserasi dengan metanol selama 24 jam Penyaringan Filtrat Evaporasi Ekstrak metanol Gambar 10 Proses ekstraksi bahan aktif (Hostetman et al. 1997) 3.3.2. Pembersihan ekstrak kasar Teknik pembersihan ekstrak dilakukan dengan cara menambahkan pelarut asal pada ekstrak dan dilakukan partisi secara berulang sampai tidak didapatkan residu pada kertas saring. Prosedur kerja pembersihan ekstrak X. granatum (akar, batang, daun, daging buah dan biji) adalah sebagai berikut: 1) ekstrak hasil evaporasi dicuci dengan menambahkan pelarutnya dengan perbandingan ekstrak dan pelarut 1:2 atau ekstrak sampai terendam, dihomogenkan dengan seker selama 1 jam dan selanjutnya didiamkan selama 24 jam dalam lemari pendingin (suhu 5 o C) dan didapatkan 2 bagian terpisah yaitu bagian filtrat dan residu, 2) dilakukan penyaringan dengan kertas saring untuk memisahkan filtrat dengan residu selanjutnya filtrat diuapkan dengan evaporator untuk memisahkan pelarutnya,
21 3) ekstrak yang diperoleh dicuci ulang dengan menambahkan pelarutnya kembali dan langkah selanjutnya sama dengan pencucian pertama, pencucian dilakukan minimal 3 kali, 3.3.3. Pengujian aktivitas inhibitor topoisomerase I Ekstrak X. granatum (akar, batang, daun, daging buah dan biji) dalam pelarut heksana, etil asetat dan metanol dilakukan uji inhibisi enzim DNA topoisomerase I. Pengujian antikanker secara in vitro bertujuan untuk melihat kemampuan sitotoksik ekstrak dalam menghambat enzim DNA topoisomerase I. Prosedur pengujian aktivitas inhibitor topoisomerase I disajikan pada Lampiran 2 dan visualisasi gel agarose dengan marker serta kontrol pada Lampiran 3. 3.3.4. Pengujian fitokimia Uji fitokimia merupakan salah satu cara untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder pada suatu ekstrak tanaman atau merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui keberadaan senyawa kimia spesifik seperti senyawa alkaloid, fenol (termasuk flavonoid), tanin, dan saponin. Prinsip dan prosedur pengujian alkaloid, flavonoid, tanin dan saponin disajikan pada Lampiran 4. 3.3.5. Pengujian antibakteri Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak metanol X. granatum (akar, batang, daun, daging buah dan biji) terdiri dari tahap persiapan dan pembuatan media, penyegaran bakteri uji dan uji aktivitas antibakteri. Metode yang digunakan pada pengujian aktivitas antibakteri adalah metode difusi agar dengan teknik agar tuang. Prinsip metode ini, yaitu ekstrak akan berdifusi langsung dalam media agar yang telah mengandung bakteri uji. Bakteri uji yang digunakan adalah S. aureus (bakteri Gram positif) dan E. coli (bakteri Gram negatif). Uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol X. granatum pada Gambar 11 dan tahapan pengujian antibakteri disajikan pada Lampiran 5.
22 Bakteri sebanyak 20 µl, OD 600 nm = 0.68 (S. aureus) dan 0.59 (E. coli), dimasukan dalam 15 ml media agar Divortex hingga homogen Dimasukkan dalam cawan petri Dibiarkan memadat (±15 menit) Penambahan ekstrak 20 µl (300 µg/ paper disc), kloromfenikol 10 µg/paper disc, ampisilin 25 µg/paper disc Disimpan dalam pendingin (30 menit) Paper disc diletakkan pada cawan petri berisi bakteri Disimpan dalam lemari Pendingin (30 menit) Diinkubasi pada suhu 37 O C (12-18 jam) Pengamatan dengan mengukur Zona bening yang terbentuk Gambar 11 Pengujian aktivitas antibakteri (Schlegel dan Schmidt 1994) 3.3.6. Penapisan ekstrak kasar Penapisan ekstrak kasar metanol batang X. granatum untuk target pemurnian senyawa kimia, dengan metode spesifik yaitu penggunaan pelarut yang tepat dengan tujuan untuk menghilangkan komponen pengotor dan mendapatkan fraksi murni. Pemurnian atau isolasi senyawa target untuk memperoleh senyawa yang memiliki bioaktifitas terbaik dari 3 golongan senyawa target yaitu alkaloid, flavonoid dan tanin. Alasan pemilihan metode isolasi spesifik karena kesulitan mendapatkan eluen yang cocok untuk memisahkan ekstrak dengan metode kromatografi lapis tipis dan kolom serta fraksinasi dengan metode ini
23 memerlukan waktu isolasi yang lama. Diagram alir penapisan, pemurnian alkaloid, flavonoid dan tanin ekstrak metanol batang X. granatum disajikan pada Gambar 12, 13 dan 14. Ekstrak kasar Maserasi selama 24 jam dalam metanol dan air (4:1) Penyaringan Filtrat Evaporasi suhu 40 o C sampai 1/10 volume awal Pengasaman dengan asam sulfat 2M (ph 3-4) Ekstraksi 3x dengan kloroform Lapisan kloroform Lapisan air-asam Evaporasi Pembasaan dengan amoniak (ph 10) Ekstrak pertengahan polar/ Ekstraksi 2x EPP/Fraksi alkaloid kloroform-metanol (3:1) Lapisan kloroform dan metanol Evaporasi Ekstrak basa/eb Lapisan air-basa Ekstraksi dengan metanol Ekstrak polar/ep Gambar 12 Penapisan ekstrak kasar (Harborne 1987) dan Pemurnian alkaloid (Martono 1983)
Ekstrak metanol batang 24 Pelarutan dengan akuades panas Penyaringan Filtrat Partisi dengan heksana Partisi dengan kloroform Partisi dengan etanol Partisi dengan etil asetat Partisi dengan butanol Fraksi butanol Fraksi flavonoid Evaporasi Gambar 13 Pemurnian flavonoid (Budzianowski 1985) Ekstrak metanol batang Partisi dengan heksana Fraksi heksana Ekstraksi dengan aseton dan air (7:3) + asam askorbat 0,1% Filtrat Evaporasi Ekstrak Partisi dengan kloroform Partisi dengan etil asetat Fraksi etil asetat Evaporasi Fraksi tanin Gambar 14 Pemurnian tanin (Makker dan Becker 1995)