BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini bersifat experimental laboratorium dengan rancangan penelitian post test only control group, karena pengukuran hanya dilakukan setelah pemberian perlakuan pada hewan uji (Taufiqurrahman, 2004). B. Lokasi Penelitian Dilaksanankan di Laboratorium Farmasi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta. C. Subyek Penelitian Tikus Putih Jantan (Rattus norvegicus) yang diinduksi larutan NaCl 8 % sehingga menjadi hipertensi. D. Teknik Sampling Teknik sampling yang digunakan adalah purposive sampling, yaitu subyek penelitian berupa Tikus Putih (Rattus norvegicus) dipilih dengan kriteria tertentu dan dibagi menjadi 5 kelompok secara acak (randomisasi) (Notoadmodjo, 2002). E. Hewan Percobaan Hewan uji yang digunakan dalam percobaan berupa tikus putih jantan (Rattus norvegicus) karena tidak terpengaruh siklus menstruasi dan proses kehamilan, dengan galur Wistar (supaya didapat latar belakang genetik yang seragam) yang diperoleh dari Laboratorium Farmasi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta, dengan usia kurang lebih 2-3 bulan dengan berat badan kira-kira 100-200 gram. Sampel sebanyak 30 ekor yang dibagi secara acak dalam 5 kelompok masing-masing kelompok terdiri atas 6 33
34 ekor tikus putih jantan. Semua tikus tersebut sebelumnya telah diinduksi larutan NaCl. Besar sampel tersebut didapat melalui perhitungan dengan menggunakan rumus Federer, yaitu : k : jumlah kelompok (k-1)(n-1) 15 n : jumlah sampel dalam tiap kelompok (k-1)(n-1) 15 (5-1)(n-1) 15 n-1 3,75 n 4,75 5 (dibulatkan) Pada penelitian ini jumlah sampel untuk tiap kelompok ditentukan sebanyak 6 ekor tikus putih (Notoadmodjo, 2002; Hernani, 2009). F. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas : ekstrak etanol daun belimbing wuluh 2. Variabel terikat : a. Tekanan Darah. Tekanan darah diukur setelah induksi larutan NaCl 8% sebelum dan sesudah pemberian perlakuan dosis ekstrak daun belimbing wuluh. b. Efek diuresis. Diukur dengan menghitung volume urin tikus putih jantan tiap 6 jam sebanyak 4 kali dimulai dari pukul 09.00 sampai pukul 09.00 sehari setelahnya. 3. Variabel pengganggu : a. Variabel pengganggu yang terkendali
35 1) Kondisi fisik hewan uji yang meliputi berat badan, usia, jenis kelamin, galur, kondisi laboratorium, alat-alat penelitian, dan pengamatan peneliti. 2) Adanya stres yang terjadi pada hewan uji akibat adaptasi lingkungan tempat percobaan. b. Variabel pengganggu yang tidak terkendali 1) Variasi kepekaan tikus putih jantan terhadap zat dan obat yang digunakan. 2) Keadaan ginjal tikus putih jantan. G. Definisi Operasional 1. Ekstrak etanol daun belimbing wuluh Ekstrak adalah sediaan sari pekat tumbuh-tumbuhan atau hewan yang diperoleh dengan cara melepaskan zat/senyawa aktif dari masing-masing obat, menggunakan pelarut yang cocok, uapkan semua atau hampir semua dari pelarutnya, dan sisa endapan atau serbuk diatur untuk ditetapkan standarnya (Ansel, 1989). Ekstrak etanol daun belimbing wuluh adalah ekstrak dari daun belimbing wuluh yang telah dikeringkan kemudian diproses dengan suatu cairan pengekstraksi yaitu etanol 70% dengan menggunakan metode perkolasi. Ekstrak tersebut akan diberikan ke hewan uji secara peroral, yang dibagi kedalam 3 dosis perlakuan. 2. Uji Tekanan Darah Tekanan darah hewan uji diukur dengan cara tail cuff method menggunakan alat blood pressure analyzer untuk hewan uji. Metode ini memungkinkan peneliti untuk mengetahui tekanan darah sistolik dan diastolik. Tekanan darah hewan uji diukur sebelum dan sesudah pemberian perlakuan dosis ekstrak daun belimbing wuluh.
36 3. Uji Efek Diuresis Efek diuresis adalah volume urine yang dikeluarkan oleh hewan uji setelah pemberian perlakuan dan dihitung selama 24 jam. Pengamatan dilaksanakan setiap 6 jam setelah pemberian perlakuan. Skala yang digunakan adalah skala rasio. Alat ukur yang digunakan adalah spuit injeksi. 4. Variasi genetik, jenis kelamin, berat badan, dan umur tikus Tikus putih yang digunakan berjumlah 30 ekor dengan galur Wistar agar variasi genetiknya seragam, berjenis kelamin jantan dan memiliki berat 150-200 gr dan berumur 2-3 bulan. 5. Makanan dan Minuman Makanan digunakan adalah pakan standar yakni pelet BR-II dan minum selama 7 hari adaptasi dan 7 hari pemberian induksi larutan NaCl. Selanjutnya tikus putih dipuasakan selama lebih kurang 18 jam sebelum perlakuan, tetapi air minum tetap diberikan (Fitriyani et al., 2011). Tujuannya adalah untuk mengosongkan lambung tikus agar ekstrak biji pepaya yang diberikan akan bekerja maksimal. 6. Suhu Tikus putih dikandangkan selama 14 hari dalam kandang yang sama dengan suhu ruangan berkisar 25 0-28 0 C agar dapat beradaptasi dan untuk menyamakan kondisi psikologis antar tikus yang dipengaruhi lingkungan sekitar. 7. Variasi kepekaan tikus terhadap zat atau obat yang diberikan Ada kemungkinan tikus memiliki kepekaan yang berbeda-beda terhadap zat atau obat yang diberikan selama penelitian.
37 H. Rancangan Penelitian 1. Uji Tekanan Darah K1 P1 T1 K2 P2 T2 S I T0 K3 P3 T3 A K4 P4 T4 K5 P5 T5 Gambar 3.1 Skema Rancangan Penelitian Uji Tekanan Darah 2. Uji Efek Diuresis K1 P1 U1 K2 P2 U2 K3 P3 U3 A K4 P4 U4 K5 P5 U5 Gambar 3.2 Skema Rancangan Penelitian Uji Diuresis Keterangan : K1 : kelompok kontrol negatif K2 : kelompok kontrol positif K3 : kelompok uji dosis I
38 K4 : kelompok uji dosis II K5 : kelompok uji dosis III P1 : pemberian aquadest 2,5 ml/100 g BB tikus putih jantan hipertensi P2 : pemberian HCT dosis 0,225 mg/100 g BB tikus putih jantan/2,5 ml air P3 : pemberian ekstrak daun belimbing wuluh dosis I (57,5 mg/100 g BB) P4 : pemberian ekstrak daun belimbing wuluh dosis II (115 mg/100 g BB) P5 : pemberian ekstrak daun belimbing wuluh dosis III (172,5 mg/100 g BB) U1 : pengukuran volume urin kelompok kontrol negatif U2 : pengukuran volume urin kelompok kontrol positif U3 : pengukuran volume urin kelompok uji dosis I U4 : pengukuran volume urin kelompok uji dosis II U5 : pengukuran volume urin kelompok uji dosis III A : analisis data S : subjek penelitian (30 ekor tikus putih jantan) I : induksi hipertensi dengan larutan NaCl 8% T0 : pengukuran tekanan setelah induksi (sebelum pemberian dosis perlakuan) T1 : pengukuran tekanan darah kelompok kontrol negatif setelah perlakuan T2 : pengukuran tekanan darah kelompok kontrol positif setelah perlakuan T3 : pengukuran tekanan darah kelompok dosis I setelah perlakuan T4 : pengukuran tekanan darah kelompok dosis II setelah perlakuan T5 : pengukuran tekanan darah kelompok dosis III setelah perlakuan
39 I. Instrumentasi Penelitian 1. Alat yang diperlukan : a. Kandang tikus putih untuk tempat mengadaptasi tikus putih jantan pada tempat percobaan. b. Timbangan hewan untuk mengukur berat badan tikus putih jantan. c. Spuit pencekok untuk memasukkan sampel uji ke tikus putih jantan per oral. d. Metabolic cage for rats kandang uji diuretik untuk tikus putih jantan. e. Kantong plastik untuk menampung urin hasil percobaan. f. Stopwatch/jam untuk mengetahui waktu pengukuran volume urin tikus putih jantan. g. Injection spuit untuk mengukur volume urin hasil uji diuretik. h. Tensimeter untuk tikus untuk mengukur tekanan darah tikus putih jantan. 2. Bahan yang diperlukan : a. Ekstrak daun belimbing wuluh b. HCT dosis 0,225 mg/100 g BB tikus putih jantan sebagai kontrol positif c. Aquadest sebagai kontrol negatif d. CMC sebagai bahan pensuspensi bahan uji e. Makanan standar tikus putih brailer-ii pellet f. Larutan NaCl 8% sebagai penginduksi hipertensi J. Perhitungan Dosis 1. Hidroklorotiazid (HCT) Faktor konversi manusia dengan berat badan (BB) 70 Kg ke tikus putih dengan BB 200 gram adalah 0,018. Dosis HCT yang digunakan sebagai diuretik adalah 25 mg/hari (Nafrialdi, 2007). Dosis terapi manusia 70 Kg dikonversi ke tikus 200 gram adalah
40 = 25 mg x 0,018/200 g BB tikus putih = 0,45 mg/200 g BB tikus putih = 0,225 mg/100 g BB tikus putih Volume cairan maksimal yang dapat diberikan per oral pada tikus putih adalah 5 ml/100 g BB. HCT tab 25 mg dilarutkan dalam 100 ml aquadest, sehingga dalam 100 ml larutan terdapat 25 mg HCT. 25 mg 100 ml X = Untuk mendapatkan 0,225 mg HCT maka : = 0,225 mg x ml 100 x 0,225 25 X = 0,9 ml Jadi, dalam setiap 0,9 ml larutan terdapat 0,225 mg HCT (perbandingan larutan : HCT adalah 4 : 1). 2. Ekstrak Daun Belimbing Wuluh Volume maksimal yang dapat diberikan per oral pada tikus putih adalah 5 ml/200 g BB. Jadi, dalam memperkirakan volume ekstrak etanol daun belimbing wuluh yang akan diuji tidak boleh melebihi 5 ml/200 g BB atau 2,5 ml/100 g BB tikus putih. Dalam menentukan dosis ekstrak etanol daun belimbing wuluh pada penelitian ini mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Hernani et al. (2009) yang menggunakan hewan uji berupa kucing. Faktor konversi kucing dengan berat badan (BB) 2 Kg ke tikus putih dengan BB 200 gram adalah 0,23. Dosis ektrak daun belimbing wuluh yang diberikan adalah 25 mg/kgbb. Dosis I merupakan angka konversi dosis tersebut, sedangkan dosis II adalah 2 kali dosis I dan dosis III adalah 3 kali dosis I. Masing-masing kelompok diberikan ekstrak selama 1 hari sesuai dengan dosisnya.
41 Dosis I = 25 mg x 0,23/Kg BB tikus putih = 5,75 mg/kg BB tikus putih = 57,5 mg/100 g BB tikus putih Dosis II = 2 x 25 mg x 0,23/Kg BB tikus putih = 11,5 mg/kg BB tikus putih = 115 mg/100 g BB tikus putih Dosis I = 3 x 25 mg x 0,23/Kg BB tikus putih = 17,25 mg/kg BB tikus putih = 172,5 mg/100 g BB tikus putih 3. Kontrol Negatif Volume cairan maksimal yang dapat diberikan per oral pada tikus putih adalah 5 ml/100 g BB. Penentuan takaran dosis maksimal yang digunakan untuk penelitian tidak disarankan untuk menggunakan lebih dari setengah volume cairan maksimal yang diberikan. Dengan demikian, maka : Volume cairan maksimal dengan BB 100 g = 5 ml Setengah dari dosis maksimal = 2,5 ml 4. Larutan NaCl 8% Volume larutan NaCl 8 % yang diberikan sebagai penginduksi hipertensi adalah 3 ml per hari untuk tikus putih jantan selama 14 hari. Dosis tersebut sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Lailani et al. (2013).
42 K. Cara Kerja Tikus Putih Jantan diadaptasi selama 7 hari Induksi Hipertensi dengan Larutan NaCl 8% 3 ml per hari selama 14 hari Ukur Tekanan Darah Kelompok Kontrol Negatif 1. Tikus putih jantan hipertensi (6 ekor) + aquadest 2,5 ml/100 g BB selama 1 hari Kelompok Kontrol Positif 2. Tikus putih jantan hipertensi (6 ekor) + 2,5 ml HCT dosis 0,225 mg/100 g BB selama 1 hari Kelompok Perlakuan I 3. Tikus putih jantan hipertensi (6 ekor) + ekstrak daun belimbing wuluh dosis 57,5 mg/100g BB selama 1 hari Kelompok Perlakuan II 4. Tikus putih jantan hipertensi (6 ekor) + ekstrak daun belimbing wuluh dosis 115 mg/100g BB selama 1 hari Kelompok Perlakuan III 5. Tikus putih jantan hipertensi (6 ekor) + ekstrak daun belimbing wuluh dosis 172,5 mg/100g BB selama 1 hari Masukkan hewan uji ke dalam Metabolic cage for rats dengan tetap memberikan induksi larutan NaCl Ukur volume urin dari semua kelompok perlakuan setiap 6 jam Ukur tekanan darah dari semua kelompok perlakuan Urin 6 jam pertama Urin 6 jam kedua Urin 6 jam ketiga Urin 6 jam keempat Analisis Data Analisis data Gambar 3.3 Skema Cara Kerja Penelitian
43 1. Membuat ekstrak etanol daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.) Pembuatan ekstrak etanol daun belimbing wuluh dilakukan Laboratorium Farmasi Universitas Gajah Mada, Yogyakarta. Daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.) diperoleh dari Merapi Farma Herbal, Jalan Kaliurang KM 21, Yogyakarta. Pembuatan ekstrak tersebut besasal dari bahan berupa daun belimbing wuluh yang telah dikeringkan kemudian diproses dengan suatu cairan pengekstraksi yaitu etanol 70% dengan menggunakan metode pembuatan ektraksi yaitu perkolasi. 2. Langkah Penelitian a. Membuat Model Hipertensi pada Hewan UJi Hewan uji dipuasakan selama 18 jam sebelum perlakuan, setelah diadaptasi selama kurang lebih 1 minggu di tempat percobaan. Hewan uji kemudian dibagi menjadi 5 kelompok secara acak, masing-masing terdiri atas 6 ekor tikus putih jantan. Kemudian tikus putih jantan ditimbang dengan menggunakan timbangan hewan, setelah itu diberi perlakuan (Fitriyani et al., 2011). Semua kelompok perlakuan sebelumnya diinduksi hipertensi dengan menggunakan larutan NaCl 8% per oral dengan volume 3 ml per hari pada tikus putih jantan selama 14 hari (Lailani et al., 2012). Pengukuran tekanan darah dapat dilakukan pada tikus hipertensi spontan atau hipertensi buatan. Pengukuran tekanan darah dengan cara Tail Cuff method menggunakan alat blood pressure analyzer untuk hewan uji. Metode ini memungkinkan peneliti untuk mengetahui tekanan darah sistolik dan diastolik. Prinsip kerja pengukuran tekanan darah adalah cuff pada ekor
44 digelembungkan sampai mencapai tekanan darah diatas tekanan darah sistolik, sehingga nadi menghilang kemudian tekanan cuff dikurangi perlahanlahan. Pada saat tekanan darah mencapai di bawah tekanan sistolik nadi akan muncul kembali. Cara pengukuran ini sesuai dengan cara pengukuran tekanan darah menggunakan sphigmomanometer pada manusia. Pengukuran tekanan darah pada metode Tail Cuff selain digunakan pada tikus juga dapat digunakan pada mencit, anjing, dan primata kecil. Tekanan darah sistol normal untuk tikus putih jantan adalah 122,25 ± 7,63 mmhg dan diastol 78 ± 9,44 mmhg. Apabila nilai tekanan darah diatas normal maka dapat dikatakan hipertensi (Ngatidjan, 2006; Lailani et al., 2012). b. Pemberian Perlakuan 1) Kelompok I yaitu tikus putih jantan diberi 2,5 ml aquadest sebagai kontrol negatif selama 1 hari. 2) Kelompok II yaitu tikus putih jantan 2,5 ml HCT dosis 0,225 mg/100 g BB, sebagai kontrol positif selama 1 hari. 3) Kelompok III yaitu tikus putih jantan diberi ekstrak daun belimbing wuluh dosis I (57,5 mg/100 g BB) selama 1 hari. 4) Kelompok IV yaitu tikus putih jantan diberi ekstrak daun belimbing wuluh dosis II (115 mg/100 g BB) selama 1 hari. 5) Kelompok V yaitu tikus putih jantan diberi ekstrak daun belimbing wuluh dosis III (172,5 mg/100 g BB) selama 1 hari. c. Uji Tekanan Darah Tekanan darah hewan uji diukur sebanyak 2 kali yaitu saat sebelum perlakuan pasca induksi dengan larutan NaCl 8% dan setelah pemberian perlakuan sesuai dengan kelompok dosis masing-masing.
45 d. Uji Efek Diuresis Setelah pemberian perlakuan, setiap tikus putih langsung dimasukkan ke dalam kandang khusus untuk uji diuretik (metabolic cage for rats) dengan tetap memberikan larutan NaCl 8 % sebagai penginduksi hipertensi. Penampungan dan pengukuran urin tikus dilakukan setiap 6 jam, selama 24 jam. L. Teknik dan Analisis Data 1. Uji Tekanan Darah Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan melakukan uji normalitas menggunakan Uji Saphiro-Wilk, dilanjutkan uji Friedman, yang dilanjutkan dengan uji Wilcoxon (Dahlan, 2010). 2. Uji Efek Diuresis Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan melakukan uji normalitas menggunakan Uji Saphiro-Wilk, dilanjutkan Kruskall-Wallis, yang dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney (Dahlan, 2010).