BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Isolasi dan perbanyakan sumber inokulum E. carotovora dilakukan di Laboratorium Bakteriologi Departemen Proteksi Tanaman Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Perlakuan inokulasi tanaman anggrek dilakukan di rumah kaca Departemen Proteksi Tanaman, Kebun Percobaan Cikabayan. Penelitian berlangsung mulai Februari hingga Oktober 2009. Metode Penyiapan Tanaman Anggrek Tanaman anggrek yang digunakan dari genus Phalaenopsis dengan spesifikasi bunga putih yang dibiakkan secara meriklon dengan kode KHM246Q. Tanaman anggrek ditanam dalam pot berdiameter 20 cm dan tinggi 20 cm. Media tanam yang digunakan yaitu arang dan peat moss. A B Gambar 1 Tanaman uji hasil meriklon (A) anggrek Phalaenopsis, (B) bunga Phalaenopsis yang berwarna putih Perbanyakan Isolat agens biokontrol Agens biokontrol yang diuji terdiri dari B. subtilis B-12, B. cereus B-13, dan P. fluorescens RH4003 koleksi Laboratorium Bakteriologi Departemen Proteksi Tanaman IPB, enam isolat B. subtilis yaitu isolat PC 2a, PC 2b, PC 31a, PC 31b, PC 31c, PC 31d dan empat isolat P. fluorescens yaitu isolat Pf2, Pf4, Pf9, dan
Pf10 koleksi Laboratorium Bakteriologi Balai Penelitian Tanaman Hias, Segunung. Seluruh isolat diperbanyak pada media Nutrien Agar. Isolasi dan Inokulasi Penyebab Busuk Lunak Isolat bakteri patogen yang digunakan merupakan hasil isolasi dari bagian tanaman dengan gejala busuk lunak yang diperoleh dari lapangan. Bagian tanaman yang bergejala dicuci bersih kemudian dipotong dan dicuci dengan alkohol 70%, setelah itu dibilas dengan aquades steril. Potongan tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi aquadest steril dan dikocok hingga ooze bakteri keluar. Suspensi bakteri diambil sebanyak 0,1 ml kemudian disebar dengan menggunakan glass beads pada media Nutrien Agar (NA) dan King s B (KB) dalam cawan petri. Setelah diinkubasikan selama 24 jam pada suhu ruang diamati perkembangan koloninya dan dimurnikan. Masing-masing isolat bakteri yang ditemukan diinokulasikan pada tanaman anggrek sehat. Pengamatan terhadap gejala yang muncul dilakukan selama 7 hari. Isolat bakteri yang menghasilkan gejala busuk lunak kemudian direisolasi dan diinokulasikan kembali pada tanaman anggrek sehat dengan metode suntik dan pelukaan permukaan dengan carborundum. Bakteri yang menghasilkan gejala yang sama pada inokulasi kedua selanjutnya diidentifikasi dan diuji patogenisitasnya. Karakterisasi Bakteri Penyebab Busuk Lunak Karakterisasi bakteri patogen berdasarkan kunci (metode) identifikasi yang ditulis oleh Schaad et al. (2001). Uji patogenisitas dilakukan untuk mengetahui bakteri uji bersifat patogen atau tidak. Beberapa pengujian terhadap sifat fisiologi dan biokimia yang dilakukan adalah: Uji Gram (KOH) Uji ini dilakukan untuk mengetahui bakteri bersifat Gram negatif atau Gram positif. Pengujian dilakukan dengan mencampurkan satu lup bakteri uji pada preparat yang telah ditetesi KOH 3%. Pengamatan dilakukan pada terbentuknya lendir pada saat lup inokulasi ditarik ke atas.
Kelompok bakteri Gram negatif ditandai dengan terbentuknya lendir saat lup inokulasi ditarik ke atas. Bila tidak terbentuk lendir, maka termasuk dalam kelompok bakteri Gram positif. Uji Anaerobic growth (Oksidatif/Fermentatif) Pengujian dilakukan dengan menggunakan media pertumbuhan anaerob. Dua tabung reaksi yang telah diisi dengan media anaerob ditambahkan 0,5 ml glukosa steril dan diinokulasi dengan isolat bakteri uji sedalam 0,5 cm. Salah satu tabung reaksi tersebut ditutup dengan 0,3 ml parafin oil. Kontrol yang digunakan berupa media tanpa inokulasi bakteri. Tabung reaksi diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Pengamatan dilakukan berdasarkan terjadinya perubahan warna pada media uji tersebut. Bakteri bersifat oksidatif bila terjadi perubahan warna menjadi kuning hanya pada media tanpa parafin oil, sedangkan media dengan parafin oil tidak mengalami perubahan warna. Bila media dengan parafin oil dan tanpa parafin oil berubah warna menjadi kuning, maka bakteri tersebut bersifat fermentatif. Uji Levan Isolat bakteri uji yang berumur 24 jam digoreskan pada media uji. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 3-4 hari. Bila pada media terbentuk koloni berwarna putih, cembung, dan berlendir maka menandakan reaksi positif. Uji Oksidase Kertas saring steril ditetesi dengan 1% larutan tetramethyl-pphenylenediamine dihydrochloride, kemudian isolat bakteri berumur 24 jam digoreskan pada permukaan kertas tersebut. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna menjadi ungu pada kertas saring setelah 10 detik. Uji Pectolytic activity (pembusukan pada kentang) Kentang yang telah diiris setebal 1 cm disterilisasi permukaannya dengan etanol dan dibilas dengan aquades steril selama 1 menit. Isolat bakteri yang berumur 24 jam digoreskan pada permukaan kentang tersebut dan diinkubasi dalam cawan petri. Setelah 24 jam dilakukan pengamatan pada permukaan kentang. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya pembusukan pada kentang. Permukaan kentang yang diinokulasi menjadi lunak, berlendir, dan berwarna pucat.
Uji Arginine dihydrolase Media arginine dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian diinokulasi dengan bakteri uji. Jarum inokulasi yang telah terdapat bakteri uji, ditusukkan ke dalam media sedalam 0,5 cm dan ditutup dengan parafin oil. Reaksi positif ditunjukkan dengan terjadinya perubahan warna media dari oranye menjadi merah muda. Skrining Beberapa Isolat Bacillus spp. dan P. fluorescens yang Bersifat Antagonis terhadap E. carotovora secara in vitro Isolat E. carotovora dan bakteri biokontrol sebanyak 13 macam masingmasing dibiakkan dalam media Luria Broth (LB). Inokulasi E. carotovora pada media padat dilakukan dengan metode tuang, yaitu 1 ml suspensi E. carotovora (kerapatan 10 8 10 9 cfu/ml) dicampurkan ke dalam media yang belum memadat, kemudian dituang ke dalam cawan petri. Setelah media memadat, kertas saring steril berdiameter 0,5 cm diletakkan di bagian tengah media. Kertas saring tersebut diberi 20 µ suspensi bakteri biokontrol, untuk kontrol tidak diberi perlakuan bakteri biokontrol. Percobaan dilakukan pada dua jenis media padat yaitu Nutrien Agar (NA) dan King s B (KB) dengan ph 7. Cawan petri yang telah diberi perlakuan kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Pengamatan dilakukan dengan menghitung lebar zona bening yang terbentuk disekitar kertas saring. Uji antagonis dilakukan terhadap bakteri biokontrol Bacillus spp. dan P. fluorescens dengan 13 isolat yang berbeda ditambah 1 kontrol. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 2 kali (duplo). Isolat Bacillus spp. dan P. fluorescens yang menunjukkan zona hambatan selanjutnya diuji kompatibilitas antar isolat. Uji Kompatibilitas Antar Agens Biokontrol secara in vitro Isolat bakteri biokontrol yang menghasilkan zona hambatan pada uji antagonisme dilakukan uji kompatibilitas. Metode inokulasi biokontrol sama dengan metode inokulasi pada uji antagonisme. Setiap biokontrol diuji kompatibilitasnya dengan biokontrol lain. Percobaan dilakukan pada media KB ph 7. Cawan petri yang telah diberi perlakuan kemudian diinkubasi pada suhu
ruang selama 48 jam. Pengamatan dilakukan dengan menghitung lebar zona bening yang terbentuk disekitar kertas saring. Perlakuan dengan zona bening terkecil atau tidak menghasilkan zona bening menunjukkan bahwa kedua bakteri tersebut kompatibel. Uji kompatibilitas dilakukan terhadap bakteri biokontrol Bacillus spp. dan P. fluorescens dengan 42 perlakuan ditambah 7 kontrol. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 2 kali (duplo). Isolat Bacillus spp. dan P. fluorescens yang kompatibel akan digunakan dalam uji antagonisme secara in vivo pada tanaman anggrek. Pengaruh Konsentrasi Agens Biokontrol terhadap Kemunculan Gejala dan Perkembangan Diameter Gejala Penyakit Busuk Lunak secara in vivo Isolat E. carotovora dan bakteri biokontrol (Bacillus spp. dan P. fluorescens) ditumbuhkan dalam media LB dan di-shaker selama 15 jam. Inokulasi dilakukan dengan pelukaan sebanyak 5 titik pada setiap permukaan daun anggrek menggunakan jarum syringe. Pada titik-titik tersebut kemudian disemprotkan 5 ml suspensi E. carotovora dan dikeringanginkan. Setelah suspensi E. carotovora mengering, pada titik yang sama disemprotkan 5 ml suspensi biokontrol sesuai perlakuan. Perlakuan biokontrol yang diberikan yaitu: Ko : Tanpa perlakuan biokontrol (kontrol) P1 : 0 ml Bacillus spp. + 200 ml P. fluorescens P2 : 25 ml Bacillus spp. + 175 ml P. fluorescens P3 : 50 ml Bacillus spp. + 150 ml P. fluorescens P4 : 75 ml Bacillus spp. + 125 ml P. fluorescens P5 : 100 ml Bacillus spp. + 100 ml P. fluorescens P6 : 125 ml Bacillus spp.+ 75 ml P. fluorescens P7 : 150 ml Bacillus spp.+ 50 ml P. fluorescens P8 : 175 ml Bacillus spp. + 25 ml P. fluorescens P9 : 200 ml Bacillus spp. + 0 ml P. fluorescens
A Gambar 2 Perlakuan bakteri patogen dan biokontrol pada tanaman (A) inokulasi dengan metode tusuk, (B) aplikasi bakteri patogen dan biokontrol B Inokulasi dilakukan pada sore hari ketika suhu di dalam rumah kaca turun hingga 26-27 o C. Tanaman yang telah diberi perlakuan bakteri patogen dan biokontrol kemudian disungkup dengan plastik selama 12 jam. Penyungkupan tanaman dilakukan dengan tujuan menciptakan kondisi lingkungan yang lembab agar bakteri patogen dapat beradaptasi dan berpenetrasi pada jaringan tanaman. Pengamatan dilakukan setiap hari hingga 18 hari setelah inokulasi (HSI). Parameter yang digunakan yaitu peluang kemunculan gejala dan perkembangan diameter terhadap waktu inkubasi. Penghitungan peluang terjadinya penyakit didasarkan pada kemunculan gejala pada titik-titik inokulasi. Gejala yang muncul menunjukkan keberhasilan patogen menginokulasi tanaman. Persentase kemunculan gejala dihitung dengan rumus: % Kemunculan gejala = titik yang bergejala pada satu tanaman x 100% titik inokulasi pada satu tanaman Titik-titik inokulasi yang menunjukkan gejala busuk lunak dihitung diameter gejalanya. Perkembangan diameter gejala dihitung dengan menggunakan rumus: Rata-rata diameter gejala = diameter pada titik yang bergejala pada satu tanaman titik inokulasi pada satu tanaman
Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan pada pengujian pengaruh agens biokontrol secara in vivo adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan 9 perlakuan biokontrol ditambah 1 kontrol. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 2 kali dengan daun sebagai ulangan dan disusun dalam 5 kelompok perlakuan. Analisis data dilakukan dengan menggunakan program Statistical Analysis System (SAS) versi 6.12 dan uji lanjut dengan uji selang berganda Duncan pada taraf nyata α = 0,1.