III. METODOLOGI PENELITIAN 3.1. BAHAN DAN ALAT Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah beras varietas Cisadane dan daun mindi, serta bahan-bahan kimia seperti air suling/aquades, n-heksana p.a., metanol p.a., metanol teknis, kloroform p.a., alkyl benzene sulfonat (ABS), NaOH 0,1 N, etanol 95%, dan phenolftalin. Sampel beras yang digunakan dalam penelitian ini adalah beras pecah kulit (BPK). Sampel tersebut diperoleh dengan memasukkan gabah ke dalam mesin pemecah kulit (rice huller) untuk memecah sekam dari gabahnya. Daun mindi sebagai bahan utama penelitian diperoleh dari BALITRO (Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat) Bogor. Serangga uji yang digunakan adalah Sitophilus zeamais Motschulsky yang diperoleh dari BIOTROP, Bogor. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mesin pemecah kulit (rice huller), gelas plastik, kain blacu, karet gelang, penghancur (blender), buret, desikator, timbangan analitik, oven, ayakan 60 mesh, corong buchner, pompa rotary, rotary evaporator, shaker, sonikator, heater, kertas saring, gelas piala, erlenmeyer, corong gelas, sudip, gelas ukur, dan pipet tetes. 3.2. METODE PENELITIAN Penelitian ini meliputi tahap persiapan, penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Tahap persiapan terdiri dari pembiakan serangga S. zeamais, dan pembuatan ekstrak bahan nabati. Penelitian pendahuluan terdiri dari penentuan volume insektisida nabati yang disemprotkan dan pembuatan konsentrasi formula larutan stok emulsifiable concetrate (EC). Penelitian utama terdiri dari uji retensi formula emulsifiable concentrate (EC) dan aplikasi pada beras. 3.2.1. Tahap Persiapan 3.2.1.1. Pembiakan Serangga S. zeamais (stock culture) Serangga S. zeamais diperoleh dari BIOTROP yang sudah dewasa. Serangga kemudian ditempatkan dalam wadah yang telah diberi jagung fumigasi sebagai makanan dan tempat berkembang biak. Jagung fumigasi ini dapat diperoleh dengan cara pipilan jagung dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 50 0 C dalam waktu 1 jam. Tujuan dari pengovenan ini yaitu untuk mematikan serangga yang hidup yang mungkin ada pada media jagung pipil. Jagung ini harus diganti dengan yang baru setiap dua minggu agar serangga dapat berkembang biak dengan baik. Serangga ini dijadikan sebagai stock culture untuk penelitian tanpa harus meminta lagi dari BIOTROP. 3.2.1.2. Pembuatan Ekstrak Bahan Nabati Pada pembuatan ekstrak, daun mindi dikeringkan terlebih dahulu dalam oven pada suhu 60 o C selama 1 jam. Setelah bahan menjadi kering kemudian diblender untuk menghancurkan bahan nabati tersebut. Bahan nabati yang telah dihancurkan kemudian disaring dengan ayakan 60 mesh. Proses ekstraksi dimulai dengan mencampur 50 gram bagian tepung bahan nabati dengan 250 ml 16
heksana, kemudian diletakkan dalam alat shaker dan didiamkan selama 24 jam. Kemudian setelah selesai, filtrat tersebut disaring dengan kertas saring dengan menggunakan peyaring vakum. Filtrat yang diperoleh dievaporasi dengan rotary evaporator pada suhu 55 0 C (Samiwahyufiranalah 1998), sehingga diperoleh pekatan yang menyerupai minyak. Pekatan menyerupai minyak inilah yang digunakan sebagai ekstrak. Pembuatan ekstrak bahan nabati ini mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh Sonyaratri (2006) terhadap daun mindi dan daun mimba, serta penelitian yang dilakukan oleh Setiawan (2010) untuk mengkaji daya insektisida pada daun mimba. Ekstrak daun mindi dapat dilihat pada Gambar 4. Gambar 4. Ekstrak Daun Mindi 3.2.2. Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan ini terdiri atas dua tahap yaitu tahap pertama menentukan banyaknya volume cairan yang disemprotkan pada beras dan tahap kedua yaitu tahapan untuk mendapatkan konsentrasi formulasi dari bahan nabati dalam bentuk emulsifiable concentrate (EC). Untuk tahap pertama, cara yang dilakukan yaitu dengan menyemprotkan cairan emulsi pada sampel beras yang ditempatkan pada gelas plastik dengan bobot 100 gram. Variasi volume yang disemprotkan adalah 2 ml, 4 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, dan 12 ml dan dilihat secara visual persebaran dari cairan tersebut pada beras. Pada tahap kedua untuk membuat suatu insektisida nabati dalam bentuk emulsifiable concentrate bahan-bahan yang diperlukan adalah ekstrak bahan nabati, bahan pembawa, dan bahan pengemulsi. Konsentrasi ekstrak bahan nabati yang ditambahkan bervariasi yaitu 20%, 25%, 30%, 35%, dan 40%. Bahan pembawa yang digunakan adalah metanol dan bahan pengemulsi yang digunakan adalah Alkyl Benzene Sulfonat dengan variasi konsentrasi yang disesuaikan dengan perbandingan 5:1. Analisis terhadap formula dilakukan untuk menentukan stabilitas emulsi. Perbandingan konsentrasi ekstrak bahan nabati, bahan pembawa dan bahan pengemulsi dapat dilihat pada Tabel 4. 17
Tabel 4. Perbandingan konsentrasi ekstrak bahan nabati, bahan pembawa, dan bahan pengemulsi Ekstrak bahan Nabati Bahan Pembawa Bahan Pengemulsi 20 % 66,67 % 13,33 % 25 % 62,50 % 12,50 % 30 % 58,33 % 11,67 % 35% 54,67 % 10,83 % 40 % 33,33 % 10,00 % 3.2.3. Penelitian Utama 3.2.3.1. Uji Retensi Formula Emulsifiable Concentrate (EC) Uji retensi formula emulsifiable concentrate (EC) dilakukan untuk mengetahui retensi (dalam hitungan hari) insektisida nabati yang efektif dalam menghambat serangan serangga setelah penyemprotan. Beras sebanyak 100 gram ditempatkan dalam suatu wadah plastik. Variasi konsentrasi yang disemprotkan adalah 0 % (tanpa ekstrak bahan nabati), 8 %, dan 16 %. Sampel didiamkan dalam suhu ruang selama waktu yang ditentukan yaitu 1 hari, 3 hari, 5 hari, 7 hari, dan 9 hari. Setelah waktu ujinya tiba, sebanyak 100 ekor S.zeamais diinfestasikan ke dalam beras tersebut dan pada hari berikutnya dihitung berapa banyak yang mati. 3.2.3.2. Aplikasi pada Beras Beras sebanyak 100 gram ditempatkan dalam suatu gelas plastik. Ektrak bahan nabati yang sudah berbentuk emulsifiable concentrate disemprotkan ke dalam wadah tersebut dengan variasi konsentrasi 0%, 4%, 8%, 12% dan 16%. Sebanyak 25 ekor serangga S. zeamais dewasa diinfestasikan ke dalam sampel beras. Selanjutnya sampel diinkubasi pada suhu dan kelembaban ruang selama 5 minggu. Setelah itu dilakukan pengayakan untuk menghitung populasi S. zeamais Motsch. Pengujian untuk setiap konsentrasi dilakukan sebanyak tiga ulangan. 3.3. ANALISIS DAN PENGAMATAN 3.3.1. Jumlah Total Populasi Serangga (Nt) Jumlah total populasi serangga dari masing-masing ulangan untuk tiap konsentrasi dihitung dengan cara mengayak beras yang telah disimpan untuk memudahkan menghitung serangga. 3.3.2. Persen Biji Berlubang (%BB) Biji yang berlubang merupakan parameter kerusakan karena biji tersebut dapat berlubang karena digunakan oleh serangga sebagai tempat berkembang biak dan sumber makanannya. Beras yang telah melalui masa simpan, di screening secara manual untuk memisahkan biji yang masih utuh dan biji yang berlubang. Biji yang berlubang dapat mudah teramati secara visual sehingga 18
dapat mudah dipisahkan dari biji yang masih utuh. Biji yang sudah berlubang kemudian dihitung jumlahnya dan dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: % BB = Nd/N x 100 3.3.3. Persen Kehilangan Bobot (% KB) Pada biji yang telah disimpan dan diinvestasi akan mengalami penurunan bobot karena selama masa simpan serangga menggunakan beras tersebut sebagai sumber makanannya dan tempat berkembang biak. Kehilangan bobot ini dapat dihitung dengan memisahkan anatara biji yang masih utuh dan biji yang sudah berlubang kemudian ditimbang masing-masing bobotnya. Setelah didapatkan data tersebut maka dapat dilanjutkan menghitung persen kehilangan bobot dengan rumus sebagai berikut : % KB = x 100% Keterangan : U = bobot fraksi biji utuh D = bobot fraksi biji berlubang Nu = jumlah fraksi biji utuh Nd = jumlah fraksi biji berlubang N = jumlah biji dalam sampel (Nu + Nd) 3.3.4. Persen Fraksi Bubuk yang Timbul (%Frass) Bubuk yang timbul ini merupakan hasil samping dari beras yang sudah mengalami kerusakan (berlubang) akibat dari kegiatan serangga memakan beras tersebut. Untuk menghitung bubuk yang timbul, masing-masing sampel beras diayak dengan saringan untuk memisahkan antara beras dan bubuk yang ada. Kemudian sampel beras awal sebelum diinvestasi ditimbang dan dibandingkan dengan berat bubuk yang timbul dan dapat dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut : % frass = (berat fraksi bubuk)/(berat beras awal) x 100 3.3.5. Analisis Kadar Air (AOAC 1995) Pengukuran kadar air dilakukan dengan menggunakan metode oven. Langkah awal pengukuran kadar air adalah dengan mengeringkan cawan alumunium pada suhu 100 0 C selama 15 menit, kemudian didinginkan di dalam desikator selama 10 menit. Cawan alumunium kemudian ditimbang dengan menggunakan neraca analitik (a gram). Sebanyak 2-10 gram (x gram) sampel ditimbang dalam cawan alumunium yang telah diketahui bobot kosongnya. Kemudian dikeringkan dalam oven 105 0 C selama 5 jam, lalu di dinginkan di dalam desikator dan ditimbang sampai diperoleh bobot konstan (y gram). Perhitungan kadar air dilakukan dengan menggunakan rumus : 19
% 3.3.6. Analisis Asam Lemak Bebas (AOAC 1995) Sebelum dianalisis asam lemak bebasnya, masing-masing sampel diekstrak lemaknya dengan menggunakan metode Folch (Folch et al. 1957 diacu dalam Sudarmadji et al. 2008) yang dimodifikasi. Tujuan dari pengekstrakkan lemak dengan metode tersebut yaitu agar menghasilkan lipid yield recovery yang tinggi sehingga lemaknya bisa digunakan untuk analisis asam lemak bebas (Saeid 2011). Metode tersebut dapat dilihat di Lampiran 9. Sampel lemak yang telah didapat ditambahkan 15 ml etanol 95% netral sambil dipanaskan agar cepat larut lalu ditambahkan 2 tetes indikator phenolftalin. Goyang-goyang agar tercampur homogen. Sampel dititrasi menggunakan NaOH 0,1 N sambil digoyang kuat sampai warna pink permanen selama 30 detik. Kadar asam lemak bebas (%) = Keterangan : V = Volume NaOH (ml) N = Normalitas NaOH hasil standarisasi M = Berat molekul contoh (sesuai dengan jenis lemak dominan contoh) W = Berat sampel beras (g) 3.4. RANCANGAN PERCOBAAN Rancangan percobaan yang dilakukan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap sederhana dengan 3 kali ulangan untuk setiap tingkat konsentrasi bahan nabati. Model matematika rancangan acak lengkap sederhana adalah: Yij = + Ai + ij dimana Yij Ai ij = nilai pengamatan = nilai rata-rata umum = pengaruh taraf perlakuan ke-i = galat percobaan 20